牙周不同环境因素对牙周膜干细胞成骨分化作用的影响及干预

摘要

目的：
　　本研究旨在观察间接共培养条件下成骨细胞对PDLSCs成骨分化作用的影响;在进一步明确TNF-α对PDLSCs成骨向分化影响的基础上，探讨PGRN逆转TNF-α对PDLSCs成骨分化的抑制作用及PGRN对PDLSCs成骨向分化的直接促进作用，为深入理解牙周再生机制和完善牙周组织工程策略提供实验依据，为临床上牙周炎的治疗提供了新的方法和思路。
　　方法：
　　1.PDLSCs的分离培养与鉴定
　　1.1PDLSCs的分离培养
　　收集临床因正畸需要而拔除的健康前磨牙或由于阻生而拔除的无龋病且牙周健康的第三磨牙，刮取根中1/3的牙周膜，采用组织块及酶消化法分离培养PDLSCs，有限稀释克隆法纯化PDLSCs，取活性良好的细胞用于后续实验。
　　1.2PDLSCs的多向分化
　　在体外以10-8mol/L地塞米松，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，50mg/L维生素C诱导PDLSCs向成骨细胞分化，28d后，茜素红染色法检测矿化结节的形成;以1μM地塞米松，10μg/ml胰岛素，0.5mM IBMX，0.2mM吲哚美辛分别诱导PDLSCs向脂肪细胞分化，21d后，油红O(OilRed O)染色检测脂肪滴的形成。
　　2.成骨细胞对PDLSCs成骨分化的影响及机制
　　利用Transwell系统，将PDLSCs置于其下室，不同比例的成骨前体细胞（MC3T3-E1）及其对照细胞牙龈成纤维细胞(Human gingival fibroblasts，HGFs)置于上室，成骨诱导培养基下共培养。检测PDLSCs的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase activity，ALP)活性及碱性磷酸酶(ALP)、runt相关转录因子-2（runt-related transcription factor-2，Runx2）、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)的mRNA及蛋白的表达水平;牙骨质附着蛋白(cementum attachment protein，CAP)、牙骨质蛋白-23(cementum protein23，CP-23)mRNA表达水平;观察矿化结节的形成情况，以此说明成骨细胞对PDLSCs成骨分化和矿化的影响。
　　用ELISA评价HGFs与MC3T3-E1细胞分泌的BMP-2，以此反映成骨细胞促进PDLSCs成骨分化和矿化的机制。
　　3.TNF-α对PDLSCs成骨分化作用的影响
　　将10ng/mlTNF-α作用于PDLSCs，分别于7、14d检测PDLSCs的ALP活性，于7、14、21d检测成骨指标ALP、Runx2、OPN的mRNA及蛋白的表达水平。
　　4.PGRN对正常和炎性环境下PDLSCs成骨分化作用的影响
　　检测不同浓度PGRN对PDLSCs的增殖(cell-counting kit-8，CCK8)、ALP活性、成骨分化相关标志物mRNA表达水平的影响，筛选出PGRN促进成骨分化的最佳浓度;然后，将实验分为四组:A组:对照组:单独培养PDLSCs;B组:10ng/ml TNF-α;C组:25ng/ml PGRN;D组:10ng/mlTNF-α+25ng/ml PGRN。检测培养不同时间点PDLSCs的ALP活性;ALP、Runx2和OPN的mRNA及蛋白水平的表达;同时，于21d进行矿化结节茜素红染色和钙含量测定。
　　结果：
　　1.PDLSCs的分离培养及鉴定
　　成功分离培养出状态良好的PDLSCs。PDLSCs成骨诱导4w后用茜素红染色，镜下观察可清楚地看到大小不同的红色钙结节形成;PDLSCs成脂诱导2w后，油红O染色可见清晰红染的脂肪小滴形成。
　　2.MC3T3-E1细胞促进PDLSCs的成骨分化
　　在7、14d时，PDLSCs与MC3T3-E1细胞各共培养组（OB共培养组）的ALP活性显著高于对照组及与HGFs共培养组(p＜0.05)，其中，7d时的P1M2组和14d时的P1M1、P1M2组ALP活性表达最高。在3、7和14d时，MC3T3-E1细胞培养液中分泌的BMP-2呈时间依赖性显著高于HGFs分泌的BMP-2(p＜0.05)。
　　在多数的OB共培养组中，ALP、Runx2、OPN的mRNA表达水平明显上调，其中，7、21d的P1M2组及14d的P1M1组的ALP mRNA表达水平最高(p＜0.05);P1M2组的Runx2mRNA表达水平最高;P1M2、P2M1组的OPN mRNA表达水平高于各实验组(p＜0.05)。CAP mRNA表达在7、14d的P1M1、P1M2组，21d除了P1M4的所有OB共培养组显著增强(p＜0.05);在多数的OB共培养组中，CP-23mRNA表达水平明显上调，其中，P1M2组的表达最高。7d时，PDLSCs与MC3T3-E1细胞共培养组的ALP、Runx2、OPN的mRNA表达水平显著高于与HGFs共培养组(p＜0.05)。ALP的蛋白表达高峰出现在7、14d的P1M2组及21d的P1M1、P1M2组(p＜0.05);Runx2的蛋白表达高峰出现在7d的P1M2、P2M1组和21d的P1M1组(p＜0.05);OPN的蛋白表达高峰均在三个时间点的P1M2组(p＜0.05)。7d时，PDLSCs与MC3T3-E1细胞共培养组的ALP、Runx2、OPN的蛋白表达及矿化结节的形成均显著高于与HGFs共培养组(p＜0.05)。
　　3.TNF-α抑制PDLSCs的成骨分化
　　TNF-α浓度为10ng/ml，在7、14d时，ALP活性显著低于对照组;ALP、Runx2、OPN的mRNA及蛋白的表达水平显著低于对照组(p＜0.05)。
　　4.PGRN促进PDLSCs的成骨分化
　　4.1适当浓度的PGRN促进PDLSCs的增殖及成骨分化
　　培养24h后，与对照组相比，PGRN浓度为25，50ng/ml时，PDLSCs的增殖作用明显(p＜0.05);48和72h，PGRN浓度为5，25ng/ml时，PDLSCs的增殖作用显著高于对照组，且在25ng/ml时促增殖作用最大(p＜0.05)。7、14d时，相比于对照组，PGRN浓度为5，25ng/ml时，ALP活性明显增强(p＜0.05)，最高组均出现在25ng/ml;但浓度为100ng/ml组的增殖和ALP活性明显低于对照组(p＜0.05)。3和7d时，PGRN浓度在5，25，50ng/ml时，ALP、Runx2mRNA表达水平显著高于对照组(p＜0.05)，且浓度为25ng/ml时，两者mRNA表达水平最高(p＜0.05);浓度为100ng/ml组的ALP、Runx2mRNA表达水平明显低于对照组(p＜0.05)。
　　4.2PGRN增强了正常和炎性环境下PDLSCs的成骨分化
　　7、14d时，相比于对照组，10ng/mlTNF-α组明显抑制了PDLSCs中的ALP活性(p＜0.05)，而25ng/ml PGRN组的ALP活性明显增强，10ng/mlTNF-α+25ng/ml PGRN组与对照组相比，无统计学意义(p＞0.05)。
　　7、14、21d时，与对照组相比，10ng/mlTNF-α组的ALP、Runx2、OPN的mRNA和蛋白表达水平明显下调，25ng/ml PGRN组的ALP、Runx2、OPN的mRNA和蛋白表达水平明显上调(p＜0.05);7、14d时，10ng/ml TNF-α+25ng/ml PGRN组的Runx2mRNA表达水平高于对照组，且差异显著(p＜0.05);7d时，10ng/ml TNF-α+25ng/ml PGRN组的Runx2蛋白表达水平显著高于对照组(p＜0.05);在三个时间点中，25ng/mlPGRN组的各mRNA和蛋白表达水平最高，10ng/ml TNF-α+25ng/mlPGRN组次之。
　　PDLSCs经成骨诱导21d后，10ng/mlTNF-α组抑制了PDLSCs的矿化，而25ng/ml PGRN组促进了PDLSCs的矿化(p＜0.05)，10ng/mlTNF-α+25ng/ml PGRN组与对照组相比无统计学意义(p＞0.05)。
　　结论：
　　1.PDLSCs的成骨分化和矿化受到成骨细胞的正向影响:成骨细胞增强了PDLSCs的成骨/成牙骨质分化和矿化的能力，成骨细胞与PDLSCs的最佳比例在2∶1到1∶1范围内时，PDLSCs的成骨分化能力最强;成骨细胞增强PDLSCs的成骨/成牙骨质分化和矿化的机制与其旁分泌的BMP-2有关。
　　2.PDLSCs的成骨分化和矿化受到诸如TNF-α炎性因子的负性影响:TNF-α浓度为10ng/ml时，对PDLSCs的成骨分化起抑制作用;
　　3.PGRN能直接促进PDLSCs的增殖和成骨分化及矿化，且能逆转TNF-α对PDLSCs成骨分化的抑制作用:PGRN浓度在5，25，50ng/ml时，能促进PDLSCs的增殖和分化，且最佳浓度为25ng/ml。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

参考文献

第一部分 牙周膜干细胞的分离、培养和鉴定

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 成骨细胞对牙周膜干细胞成骨分化的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 TNF-α对牙周膜干细胞成骨分化的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第四部分PGRN逆转TNF-α对牙周膜干细胞成骨分化的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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