大肠杆菌cAMP-CRP途径调控Ⅰ型整合子中耐药基因盒表达的机制研究

摘要

细菌中日益严重的抗生素耐药性问题已经成为人类面临的最大健康威胁之一。抗生素的滥用是造成这一问题的主要原因。环境中残留的抗生素不仅可以形成选择性压力赋予耐药性细菌生存优势，有利于抗生素耐药性基因（ARGs）在同种以及异种细菌之间水平转移;还可以通过对载有ARGs的整合子等可移动遗传元件进行调控来促进耐药基因传播。Ⅰ型整合子结构较为典型，通常由5'保守区、可变区、3'保守区三部分组成。Ⅰ型整合子的5'保守区含有Ⅰ型整合酶编码基因（intI1），特异性重组位点(attI)以及基因盒启动子(Pc)。
　　本实验室通过测序分析发现用于本课题研究的大肠杆菌的Pc位于intI1编码区内，Pint位于intI1编码区外，Pc，Pint方向相反且有一段重复序列。这就为整合酶以及基因盒的共调控提供了一定的依据。的确，有研究发现在霍乱弧菌中整合酶和基因盒的表达是共调控的。根据Pc启动子-10区和-35区的不同，Pc启动子可分为不同的种类，通过本实验前期的工作发现济南水环境中Pc启动子检出频率居于前3位的分别是PcW、PcWTGN-10，PcH1。Pc上游有一段与-10区部分重复的序列，该部分为一可能的cAMP-CRP box，Pint上游-10区有一典型的LexA box。cAMP-CRP是碳阻遏调控途径的蛋白复合物，而LexA蛋白为SOS调控的关键蛋白，因此我们可以推测SOS途径或者cAMP-CRP可以对整合酶和基因盒进行调控。已有研究发现整合酶可以被SOS途径和cAMP-CRP途径共同调控且两条途径是独立的。SOS途径和cAMP-CRP途径都可以对环境压力做出反应，而环境中残留的抗生素于细菌而言就是一种环境压力。本实验室欧阳润泽发现recA阴性菌株被微量抗生素诱导之后其整合酶的表达被诱导，这也证明了整合酶可能被cAMP-CRP所调控。然而环境中抗生素的残留以及SOS和cAMP-CRP途径对基因盒又有着怎样的影响呢，立足于这一点，本课题将主要就微量抗生素以及cAMP-CRP途径对几种不同的Pc变体的耐药基因盒的调控展开研究。
　　在实验室已有的工作基础上我们使用基因工程技术敲除了原有实验菌株的crp基因，得到了crp阴性菌株（crp-）。然后利用同源重组的原理构建了Pc(PcW、PcWTGN-10，PcH1)及Pint双向启动子载体，将其转化或敲入到目标菌株（依次为recA+,crp+菌株;recA+,crp-菌株;recA-，crp+菌株;recA-，crp-菌株）中。然后使用微量浓度的不同种类抗生素处理转化或者敲入有双向启动子的菌株，一方面通过qPCR的方式检测微量抗生素处理后实验菌株crp基因转录水平的变化，另一方面再通过qPCR和报告基因检测的方式来探究微量抗生素处理后相应菌株的整合酶和耐药基因盒的转录与表达情况。
　　结果发现微量抗生素处理菌株之后crp的转录水平均表现出上升趋势，也就是说环境中残留的抗生素可以诱导细菌crp基因的表达，从而使cAMP-CRP复合物含量升高，进而激活cAMP-CRP途径。部分微量抗生素处理crp+和crp-菌株之后比较其耐药基因盒的转录水平与表达水平，发现含有crp+菌株中基因盒转录和表达水平高于crp-菌株中，这说明部分抗生素可通过cAMP-CRP途径对耐药基因盒的表达进行调控。
　　残留在环境中的抗生素一方面可通过调控整合酶的表达增强整合酶对耐药基因盒的剪接与整合能力，另一方面通过本课题的研究我们可以发现环境中残留的抗生素还可以通过诱导耐药基因盒表达的方式使细菌耐药性提高。本研究将使我们深化对抗生素诱导调控抗生素耐药性的机制的认识，并为抗生素耐药性的控制提供理论基础。

目录

声明

摘要

缩略符号说明

第一章 前言

1．1 抗生素的耐药机制介绍

1．2 整合子

1．2．1 整合子简介

1．2．2 Ⅰ型整合子结构

1．2．3 Pc启动子

1．3 影响Ⅰ型整合子整合酶及基因盒表达的因素

1．3．1 位置效应对基因盒表达水平的影响

1．3．3 cAMP-CRP途径对Ⅰ型整合酶表达的影响

1．4 课题意义及立题依据

第二章 微量抗生素对crp转录水平的影响

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 实验菌株

2．2．2 实验所用培养基及其配制

2．2．3 实验所用抗生素及其配制

2．2．4 实验所用溶液及其配制

2．2．5 本章所用引物

2．3 实验方法

2．3．1 实验菌株活化及纯化

2．3．2 细菌总基因组DNA的提取(CTAB法)

2．3．3 crp基因的检测

2．3．6 细菌总RNA提取

2．3．8 qPCR检测微量抗生素对crp转录水平的影响

2．3．9 数据处理

2．4．1 实验结果

2．4．2 本章小结

第三章 实验菌株及双向启动子载体构建

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 实验菌株

3．2．2 实验所用培养基及其配制

3．2．4 实验所用溶液及其配制

3．2．5 本章所用引物

3．3 试验方法

3．3．1 用于构建的PCR

3．3．4 crp基因敲除

3．3．5 双向启动子载体构建

3．3．6 Pc+gfp报告基因敲入

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 crp基因敲除结果

3．4．2 新构建双向启动子结果

3．4．3 基因敲入结果

3．4．4 本章小结

第四章 微量抗生素对Pint以及Pc转录及表达水平的影响

4．2．3 实验所用抗生素及其配制

4．2．4 实验所用溶液及其配制

4．2．5 实验仪器

4．3．2 诱导实验

4．3．3 细菌总RNA的提取

4．3．4 反转录实验

4．3．7 绿色荧光蛋白的检测

4．4 结果与讨论

4．4．1 Int／1及dfrA1 qPCR检测结果

4．4．2 GFP检测结果

4．4．3 本章小结

第五章 总结与展望

参考文献

硕士期间发表论文

致谢