金纳米颗粒的表面性质调控细胞氧化应激的研究

摘要

由于其优异的光学、电学、机械及生物学等性能，纳米材料被广泛应用于建筑、交通、能源、化工、航天、个人护理用品及医药等领域。纳米材料可以通过消化道、呼吸道、皮肤和静脉注射进入人体，最终进入各组织器官，进而引起各种生物学效应，包括对人体有利的效应，如纳米药物对各种疾病的治疗作用，以及对人体不利的效应，如细胞毒性。研究纳米材料的性质与生物学效应之间的关系对于控制其毒性，扩展其在生物医学领域的应用具有重要的价值。 活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是氧气分子的还原产物，包括羟基自由基(OH)、过氧化氢(H2O2)和超氧负离子(O2-)等。ROS在细胞内一旦生成，可以迅速与周围的生物分子发生相互作用，造成细胞损伤。线粒体呼吸链中泄漏的电子与氧气分子结合，导致ROS的生成。NADPH氧化酶由多种亚基组成。在静息状态下，一部分亚基位于细胞质中，另一部分亚基位于细胞膜上。在上游信号的刺激下，细胞质中的亚基会迁移到细胞膜上，与原本位于细胞膜上的亚基组装，产生催化活性。NADPH氧化酶可以催化NADPH的氧化反应，反应过程中氧气分子被还原为ROS。细胞内ROS水平的上升会引起氧化应激，进而会引发一系列下游效应，包括抗氧化酶表达水平的上升、炎症响应以及细胞死亡等。 氧化应激与癌症、神经退行性疾病、糖尿病等威胁人类健康的重大疾病息息相关。氧化应激调节剂的合理使用为相关疾病的治疗提供了新的思路。作为新型氧化应激调节剂，纳米材料在此类疾病的治疗中有广泛的应用前景。另外，氧化应激也是纳米材料引起细胞毒性的重要机制。因此，研究纳米材料的性质与氧化应激的关系对于相关疾病的治疗及纳米材料毒性的控制具有重要的意义。 以往的研究结果显示，纳米材料的组成、尺寸、形状可以调控细胞氧化应激。另外，纳米材料的表面修饰也会影响其诱导的细胞氧化应激水平。考虑到纳米材料表面性质的多样性，目前对于纳米材料表面性质与氧化应激的关系缺乏系统性研究，而且未能识别出调控细胞氧化应激的关键表面性质。为了系统研究纳米材料表面的物理化学性质对氧化应激的影响，并揭示具有氧化应激调控能力的关键表面性质，我们设计合成了7种表面性质渐变的金纳米系列，分别是疏水性(hydrophobicity，HY)、表面正/负电荷密度(positive/negative charge density，PO/NE)、表面氢键受体/给体密度(hydrogen bond acceptor/donor density，HA/HD)、表面π键密度(πbond density，PI)和表面配体分子几何结构(molecular geometry，MG)连续变化的金纳米系列。对于前6个系列，通过控制金纳米颗粒表面两种性质不同的配体的比例，实现表面性质的连续变化。对于MG系列，我们选择了6种结构不同的配体，通过计算化学方法得到各种配体的几何结构参数值，并按数值从小到大的顺序对配体进行排序，在每种金纳米颗粒表面分别修饰一种配体。透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)表征结果表明，金纳米颗粒的直径约为6nm。为了表征金纳米颗粒的表面性质，我们用碘切法搭配高效液相色谱/质谱(high-performance liquid chromatography/mass spectrome，HPLC/MS)测定金纳米颗粒表面共价连接的配体数目。基于配体数目，通过计算得到PO/NE/HA/HD/PI/MG系列金纳米颗粒表面性质的变化规律。随着金纳米颗粒编号的增加，PO/NE系列的表面正/负电荷密度、HA/HD系列的表面氢键受体/给体密度、PI系列的表面π键密度、MG系列的表面配体分子几何结构参数值依次增加。对于HY系列，我们采用改进的摇瓶法测定金纳米颗粒的LogP值。结果表明，随着HY系列金纳米颗粒编号的增加，其疏水性依次增强。以上表征结果表明，我们成功合成了7种表面性质连续变化的金纳米系列。 在多种人源细胞系中，我们评价了不同表面性质的金纳米颗粒引起细胞氧化应激的能力。通过将细胞内血红素加氧酶1(heme oxygenase1，HO-1)表达水平和H2O2水平与金纳米颗粒的表面性质进行相关性分析，发现金纳米颗粒的疏水性和表面正电荷密度与细胞氧化应激水平呈正相关，而其他5种表面性质与细胞氧化应激水平之间未表现出显著的相关性。具体来说，对于HY和PO系列的金纳米颗粒，随着疏水性和表面正电荷密度的增加，细胞内氧化应激水平逐渐增强，而且这种关系不仅局限于一种细胞系。 纳米材料对蛋白的吸附会影响其生物学效应，如免疫反应和细胞毒性等。我们对比了血清蛋白浓度对PO和HY系列金纳米颗粒引起氧化应激水平的影响。在10％和50％的血清蛋白浓度下，PO和HY系列金纳米颗粒引起的氧化应激水平是相同的。因此，血清蛋白浓度不影响这两个系列金纳米颗粒引起的氧化应激。 基于文献报道，纳米材料引起的氧化应激通常伴随着细胞摄入。然而，对于特定表面性质的纳米材料，其引起的氧化应激是否依赖于细胞摄入仍不明确。为了研究疏水及表面带正电的金纳米颗粒引起的氧化应激与细胞摄入的关系。我们分别通过TEM定性观察以及用电感耦合等离子体质谱仪定量表征了HY和PO系列金纳米颗粒的细胞摄入。结果显示，这两个系列的金纳米颗粒引起的氧化应激水平与细胞摄入水平呈正相关。进一步用细胞松弛素D(cytochalasin D，Cyto D)抑制疏水及表面带正电的金纳米颗粒的细胞摄入后，其引起的氧化应激水平也明显下降。因此，疏水和表面带正电的金纳米颗粒引起的氧化应激是依赖于细胞摄入的。 线粒体和NADPH氧化酶是细胞氧化应激的主要源头。我们首先借助化学生物学的方法，通过使用线粒体呼吸链复合物1和NADPH氧化酶的抑制剂，初步研究了疏水及表面带正电的金纳米颗粒通过何种源头引起氧化应激。基于抑制剂实验结果，通过免疫印迹实验(western blot)和荧光实验，进一步研究了疏水及表面带正电的金纳米颗粒产生氧化应激的机制。对于疏水的金纳米颗粒，NADPH氧化酶的抑制剂可以完全抑制其引起的氧化应激，说明疏水的金纳米颗粒可能通过激活NADPH氧化酶产生氧化应激。NADPH氧化酶的激活依赖于细胞质中的亚基向细胞膜的迁移。免疫印迹实验结果进一步表明，疏水的金纳米颗粒处理细胞后，细胞质中NADPH氧化酶的亚基p47phox迁移到细胞膜上，而且三种不同的人源细胞系与疏水的金纳米颗粒共孵育后，细胞膜上p47phox的表达水平与细胞内H2O2水平呈正相关。综合抑制剂和免疫印迹实验结果，疏水的金纳米颗粒通过激活NADPH氧化酶产生氧化应激。对于表面带正电的金纳米颗粒，线粒体呼吸链复合物1的抑制剂可以完全抑制其引起的氧化应激。因此，我们推断表面带正电的金纳米颗粒可能通过线粒体产生氧化应激。免疫印迹实验及荧光实验结果表明，表面带正电的金纳米颗粒引起细胞膜去极化，从而导致线粒体源ROS的产生并导致氧化应激。 小分子药物和生物大分子引起的氧化应激可以提高化疗药物的抗癌效果。鉴于疏水和表面带正电的金纳米颗粒可以引起氧化应激，因此，我们推断这两种不同性质的金纳米颗粒具有化疗增敏效果。实验结果表明，两种不同表面性质的金纳米颗粒均可以增强紫杉醇在HeLa细胞中的毒性。ROS的清除试剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)可以抑制金纳米颗粒的化疗增敏效果，证明疏水和表面带正电的金纳米颗粒的化疗增敏效果是氧化应激介导的。 通过系统研究多种表面性质连续变化的金纳米颗粒对氧化应激的影响，我们发现疏水性和表面正电荷密度是具有氧化应激调控能力的关键表面性质。进一步的机制研究结果可以精确指导纳米材料在疾病治疗中的应用及毒性的调控。在细胞水平上，我们发现疏水和表面带正电的金纳米颗粒引起的氧化应激可以提高化疗药物的细胞毒性，是一种潜在的化疗增敏剂。这一发现为纳米材料在癌症治疗中的应用提供了新的思路。

目录

声明

摘要

符号说明

1．1 引言

1．2 纳米材料简介

1．3 金纳米颗粒

1．3．1 金纳米颗粒的合成、表面修饰及表征

1．3．2 金纳米颗粒的生物效应

1．3．3 金纳米颗粒的生物应用

1．4 氧化应激

1．4．1 活性氧自由基

1．4．2 分等级的氧化应激模型

1．4．3 氧化应激与疾病

1．5 纳米材料对氧化应激的调控

1．5．1 纳米材料通过不同源头产生氧化应激

1．5．2 纳米材料调控氧化应激水平

1．6 化疗增敏

1．6．1 常见的化疗增敏剂及增敏机制

1．6．2 纳米材料成为新兴的化疗增敏剂

1．7 本研究工作的意义

第二章 金纳米颗粒的表面性质调控细胞氧化应激水平

2．1 引言

2．2 实验材料

2．3 实验仪器

2．4 实验方法

2．4．1 表面性质连续变化的金纳米系列的设计、合成与表征

2．4．2 细胞培养

2．4．3 细胞存活率实验

2．4．4 免疫印迹实验

2．4．5 细胞内过氧化氢水平检测

2．4．6 透射电子显微镜细胞成像

2．4．7 lCP-MS检测细胞摄入

2．5 结果与讨论

2．5．1 表面性质连续变化的金纳米系列

2．5．2 细胞系及金纳米颗粒浓度的选择

2．5．3 金纳米颗粒的疏水性及表面正电荷密度调控细胞氧化应激水平

2．5．4 血清蛋白浓度不影响金纳米颗粒引起的氧化应激

2．5．5 金纳米颗粒引起细胞摄入依赖的氧化应激

2．6 结论

第三章 金纳米颗粒引起氧化应激的机制研究及应用初探

3．1 引言

3．2 实验材料

3．3 实验仪器

3．4 实验方法

3．4．1 线粒体呼吸链复合物1和NADPH氧化酶抑制剂实验

3．4．2 细胞膜上p47phox表达水平检测

3．4．3 Akt蛋白的磷酸化水平检测

3．4．4 细胞内的钙离子水平检测

3．4．5 钙离子螯合实验

3．4．6 钙离子通道抑制剂实验

3．4．7 细胞膜电位检测

3．4．8 FA-PO 6和FA-HY 7的合成与表征

3．4．9 化疗增敏实验

3．5 结果与讨论

3．5．1 APO即和DPI抑制疏水的金纳米颗粒引起的氧化应激

3．5．2 疏水的金纳米颗粒导致p47phox向细胞膜迁移

3．5．3 ROT抑制表面带正电的金纳米颗粒引起的氧化应激

3．5．4 表面带正电的金纳米颗粒引起的氧化应激是钙离子介导的

3．5．5 表面带正电的金纳米颗粒激活细胞膜上的钙离子通道

3．5．6 表面带正电的金纳米颗粒导致细胞膜去极化

3．5．7 疏水及表面带正电的金纳米颗粒具有化疗增敏作用

3．6 结论

第四章 总结与展望

参考文献

附录

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文