黑线仓鼠KiSS-1/GPR54系统在季节性繁殖调控中的作用机制

摘要

我国为传统的农业大国，农作物种类多，且分布广。农作物所遭受到的生物灾害复杂多样，危害严重，如鼠害的发生已对农牧业发展以及人类生活健康造成了严重威胁。因此，要想从根源上治理鼠害，需使用有效的分子生物学或生态平衡等措施，更便捷、更具有针对性的防治鼠害。黑线仓鼠（Cricetulus barabensis）是我国华北地区典型的害鼠之一，其繁殖方式具有伴随季节周期性转变的特点，实验以黑线仓鼠为研究对象，既是研究哺乳动物季节性繁殖的良好材料，又为治理鼠害提供理论依据。本研究以分子生物学方法和技术，研究与繁殖相关的中枢调控基因KiSS-1及其受体GPR54的表达模式，以揭示KiSS-1/GPR54调控通路在连接光照等季节性因素和繁殖机制中所起到的主要作用。
　　首先，采用RT-PCR方法克隆黑线仓鼠GPR54基因全部cDNA序列，进行生物信息学分析，对与其配体KiSS-1的相互作用方式进行探究，以便通过两者的结合作用模式了解KiSS-1/GPR54调控通路的功能位点。克隆获得黑线仓鼠GPR54基因序列1102bp，其中包括全部编码区序列939bp（GenBank登录号：KF006323）。对GPR54基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行分析可知，翻译共获得213个氨基酸，对二级结构进行分析表明整体疏水性较强。将所获得的GPR54氨基酸序列与小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norvegicus）、人（Homo sapiens）等相应序列相比对，发现存在240bp左右的片段缺失，使用PredictProtein工具预测跨膜结构，仅能预测出黑线仓鼠GPR54氨基酸序列的6次跨膜结构，不具有典型的G蛋白偶联受体7次跨膜，推测可能是由于缺失片段造成了跨膜区域的中断，并与其配体KiSS-1的特异性识别位点结合有关。使用MEGA5.0软件对所获得的GPR54 mRNA序列构建了系统进化树，所获结果与传统分类学结果一致。
　　其次，检测外源褪黑激素对黑线仓鼠中枢神经和外周性腺KiSS-1/GPR54系统以及GnRH的表达模式，验证KiSS-1/GPR54系统在生殖活动中起到的作用。本研究采用外源褪黑激素注射（15天）的方式，且注射期间对黑线仓鼠的体重进行跟踪监测。雌雄处理组的体重在进行褪黑激素注射后分别于第9日和第12日开始显著低于对照组。处死后对脏器系数进行检测，对照组与处理组黑线仓鼠的副性器官（子宫、附睾）具有显著差异（p<0.05），而性腺系数差异不显著（p>0.05）。随后通过实时荧光定量PCR方法，对黑线仓鼠的中枢神经系统和外周性腺KiSS-1、GPR54 mRN A的表达差异进行了检测。结果显示：处理组下丘脑中KiSS-1基因表达量显著低于对照组（p<0.05），雌雄黑线仓鼠的性腺KiSS-1及其受体GPR54表达量也具有显著性差异（p<0.05），提示褪黑激素可能通过对KiSS-1/GPR54系统的抑制从而进一步抑制黑线仓鼠的繁殖活性，此系统可能是介导光照和黑线仓鼠繁殖的重要调控通路。对下丘脑GnRH的表达模式进行检测表明，对照组与处理组的GnRH的表达量也存在显著差异（p<0.05），且均于下丘脑KiSS-1 mRNA表达趋势相一致。推测，KiSS-1、GPR54以及GnRH都是作用于下丘脑-垂体-性腺轴进而调控繁殖活性的重要因子。
　　最后，对自然季节黑线仓鼠KiSS-1、GPR54基因的表达量进行检测，并使用激素含量检测和实时荧光定量两种方式，验证了黑线仓鼠KiSS-1/GPR54系统对繁殖活动的季节性调控及生殖发育的作用。其中，对血清中褪黑激素和Kisspeptin的含量进行分析，发现光周期作为调节因子发挥了重要作用。对中枢神经下丘脑KiSS-1基因的表达量检测发现雌雄黑线仓鼠均为夏季表达量最高，GPR54的表达则有性别差异，雌性为冬季显著低于其他三个季节（p<0.05），雄性则表现为夏季显著性低表达（p<0.05）。对外周性腺检测发现，卵巢KiSS-1和GPR54表达量均呈现出春季显著高表达（p<0.05），睾丸中则呈现了不同的表达模式，即春、秋季节KiSS-1表达量显著高于夏、冬季（p<0.05），而GPR54的表达量为春、秋季低于夏、冬季，表现一种对其配体KiSS-1代偿性的增加。综合推断，下丘脑的表达模式可能更趋向于受到外界环境因子调控，性腺的表达则更多的与黑线仓鼠的繁殖活动的季节循环周期相一致，而雌雄性腺KiSS-1 mRNA所呈现的不同的表达模式，推测是由于下丘脑不同核区对性激素的正负反馈机制存在性别差异，使中枢神经系统发出的不同信号对机体的繁殖调控产生了雌雄表达模式差异。
　　综上所述，本研究通过自然季节取样和褪黑激素处理两种方法证实了KiSS-1/GPR54系统在介导季节性繁殖中至关重要的作用，特别是褪黑激素介导光周期对黑线仓鼠的下丘脑-垂体-性腺轴繁殖活性的调控。更深入的从分子水平验证了黑线仓鼠的季节性繁殖机制，从基因水平为更好的防治鼠害提供理论依据。

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1 文献综述

1.1 黑线仓鼠的研究概况

1.2 季节性繁殖

1.3 褪黑激素的研究进展

1.4 GPR54 的研究现状

1.5 KiSS-1/GPR54 系统的研究进展

1.6 注射给药的介绍

1.7 实时荧光定量PCR 的介绍

2 研究目的与意义

3 材料与方法

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 数据分析

4 结果与分析

4.1 体重监测数据分析

4.2 脏器系数检测

4.3 发情周期检测

4.4 激素的测定

4.5 分子生物学检测结果

5 讨论

5.1 GPR54 的跨膜区域结构分析

5.2 KiSS-1/GPR54 系统进化分析

5.3 褪黑激素处理对脏器系数、体重的影响

5.4 褪黑激素处理对 KiSS-1/GPR54 系统及相关基因 GnRH 表达量的调

5.5 KiSS-1/GPR54 系统的季节性繁殖调控分析

6 结论与展望

参考文献

在校期间发表的论文

致谢