CaN-NFAT信号通路在应力介导的成肌细胞凋亡中的作用及其作用机制

摘要

目的:颌面部肌肉组织的适应性改建在正畸功能矫形中都发挥了重要作用。成肌细胞是构成颌面部肌肉组织的重要组成部分，是适应性改建的主要体现者。目前多数学者的研究集中于成肌细胞的分化、增殖等方面，忽视了成肌细胞凋亡方面的研究。而成肌细胞的凋亡与成肌细胞的分化、增殖一样，在颌面部肌肉组织的生长和改建中发挥着重要的作用。本研究通过构建成肌细胞力学刺激模型研究周期性张应力对大鼠L6成肌细胞凋亡的影响，明确CaN-NFAT信号通路在应力介导的大鼠L6成肌细胞凋亡中的作用，从而阐明功能矫形时成肌细胞适应性改建的分子机制，为正畸医生治疗错颌畸形提供理论支持。
　　方法:本实验应用多通道细胞牵张应力加载系统对大鼠L6成肌细胞构建的力学刺激模型分别施加0h、1h、2h、6h、12h、24h的周期性张应力(0h组即为对照组)，加载的力值为15％的细胞形变率，加载的频率为10个循环/min，每个循环均包括3s拉伸和3s松弛;于倒置相差显微镜下对成肌细胞的形态学改变和生长状况进行观察;经过Hoechst33258荧光染料染色后，采用荧光显微镜观察凋亡的成肌细胞;采用流式细胞术分别分析各组成肌细胞的凋亡率;运用实时荧光定量PCR技术及Westernblot技术分别检测周期性张应力作用下各组成肌细胞钙调神经磷酸酶(CaN)及NFAT的mRNA和蛋白含量;采用CaN的特异性抑制剂环孢素(CsA)明确CaN在周期性张应力介导的L6成肌细胞凋亡中的作用，从而进一步明确内质网应激与应力介导的大鼠L6成肌细胞凋亡之间的关系。采用统计学软件SPSS17.0对所得的数据进行统计学分析。
　　结果:
　　1.大鼠L6成肌细胞在受到大小为15％细胞形变率，频率为10个循环/min的周期性张应力后，贴壁生长情况良好，细胞无变性并且脱落率极低，说明成肌细胞体外培养-力学刺激模型构建成功;
　　2.当大鼠L6成肌细胞受到长时间的周期性张应力作用后，细胞排列方向由原先的杂乱无章变为顺应力场方向排列，并且随着应力作用时间变长，细胞排列方向变得更加明显;
　　3.Hoechst33258荧光染色及流式细胞术的检测结果显示15％的细胞形变率，10个循环/min的周期性张应力诱导大鼠L6成肌细胞发生凋亡，并且在一定的作用时间范围内，成肌细胞的凋亡率随着应力作用时间的延长而升高，在24h达到高峰;
　　4.实时荧光定量PCR的检测结果显示，随着应力作用时间的延长，钙调神经磷酸酶(CaN)及NFAT的mRNA表达量均有所增加;Western blot的检测结果显示，随着应力作用时间的延长，NFAT的蛋白量也有所增加，这与PCR的检测结果相符;可见，CaN-NFAT信号通路参与了周期性张应力作用下的大鼠L6成肌细胞的力学信号传导。
　　5.CaN的特异性抑制剂环孢素(CsA)抑制CaN活性后，成肌细胞的凋亡率下降，钙调神经磷酸酶(CaN)和NFAT的mRNA表达量、NFAT的蛋白量下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.15％的细胞形变率，10个循环/min的周期性张应力可以诱导大鼠L6成肌细胞发生凋亡;
　　2.CaN-NFAT信号通路可能参与周期性张应力介导的大鼠L6成肌细胞凋亡。