共抑制PD-1和CTLA-4的表达对小鼠H22肝癌的治疗作用

摘要

目的：本研究主要是通过RNA干扰技术将siRNA转染进入荷瘤小鼠的体内，从而下调PD-1和CTLA-4在荷瘤小鼠体内的表达，进而探讨共抑制PD-1和CTLA-4的表达对小鼠H22肝癌细胞生长的抑制作用。 方法：将鼠源的H22肝癌细胞在ICR品系的小鼠腹腔内进行细胞培养并连续传代三次，再在另一只ICR品系的小鼠的右前肢腋下建立移植肿瘤动物模型。将成功荷瘤的小鼠随机分为四组：对照组（CT组）、siPD-1转染组(siPD-1组)、siCTLA-4转染组（siCTLA-4组）和联合转染组(siPD-1+siCTLA-4组)，使得每组荷瘤小鼠的肿瘤体积的大小基本保持一致。本实验主要是通过给每只荷瘤小鼠注射siRNAs和动物体内转染试剂进行实验，实验中每日观察小鼠的存活时间和基本的生理状况。测量实体瘤的体积和重量以评估siRNAs对肿瘤的抑制作用。酶联免疫吸附法（ELISA法）检测荷瘤小鼠血液中IFN-γ和IL-10的含量以及肿瘤组织和肝脏组织中PD-L1蛋白的表达量。利用实时荧光定量PCR技术（qPCR技术）检测肿瘤组织中IFN-γ、PD-L1、IL-6和Survivin，肝脏组织中IFN-γ、PD-L1与脾脏组织中IFN-γ、PD-1、CTLA-4各个基因的mRNA表达情况，分析在mRNA水平上siRNA对各个基因mRNA表达的影响。蛋白质分子印迹（Western Blot技术）检测Bax和Bcl-2蛋白的相对表达量，通过计算其二者灰度值的比值分析siRNA对肿瘤细胞凋亡的影响。 结果：单独和联合转染siRNA组均显示出抗肿瘤作用，联合抑制组对肿瘤细胞生长的抑制作用尤为显著；联合转染组小鼠生存率（100%）、siPD-1组(75%)、siCTLA-4组（71%）、对照组（30%）；与对照组相比，其它三个siRNA干扰组小鼠血液中的IFN-鼠的表达量显著升高，而IL-10在小鼠血液中的表达量明显降低(P＜0.05)；PD-L1的mRNA和蛋白的表达量均在肿瘤组织中升高而在肝脏组织中显著降低(P＜0.05)；siPD-1组、siCTLA-4组、siPD-1+siCTLA-4组脾脏组织中PD-1及CTLA-4基因表达量显著降低，IFN-量在肿瘤组织中均明显升高，而肿瘤组织中的Survivin、IL-6表达量下调，与对照组比较各基因表达量差异均具有统计学意义(P＜0.05)；利用RNAi阻断PD-1/PD-L1和CTLA-4/CD28通路可增强T细胞活性，脾脏组织中IFN-γ，表达量相对升高(P＜0.05)。Western Blot技术的检测结果也显示使用siRNA进行干扰之后，肿瘤组织中Bax蛋白的表达量升高，而Bcl-2蛋白的表达量降低，通过计算Bax与Bcl-2的比值显著性提高(P＜0.05)。这些结果表明，下调PD-1和CTLA-4可以增加机体的免疫力并促进肿瘤细胞的凋亡。 结论：单独或联合抑制PD-1和CTLA-4在小鼠体内的表达均能够有效地抑制小鼠H22肝癌细胞的生长和增殖，并促进H22肿瘤细胞的凋亡，对小鼠H22肝癌具有有效的治疗作用。同时抑制PD-1与CTLA-4的表达也增强了T淋巴细胞的活力，提高了机体的免疫力，改善肿瘤内的微环境。

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