太平洋真鳕(Gadus macrocephalus)碎肉肽钙复合物的制备及其促钙吸收作用研究

摘要

以太平洋真鳕(Gadus macrocephalus)碎肉为原料，采用双酶偶联水解获得活性肽，通过其与钙离子螯合制备碎肉肽钙复合物（Gadus macrocephalusmincedpeptides calcium complex，GMMP-Ca），并采用Caco-2细胞模型研究复合物的促钙吸收功能，主要结论如下： 1.通过酪蛋白平板初筛和发酵培养复筛，从刺参(Apostichopus iaponicus)肠道中筛选出一株高产蛋白酶菌株HSCD-3，通过16S rDNA鉴定确定其为芽孢杆菌属（Bacillus）。该菌株发酵培养48h后，测得发酵液酶活为89.86U/mL。发酵液经超滤浓缩、硫酸铵沉淀、冷冻干燥后获得粗酶BP-1，SDS-PAGE显示其蛋白分子量约为30.8kDa。该酶最适温度为50℃，在4~50℃能保持85%以上的酶活性，具有良好的热稳定性；最适pH8.0，在pH6~10范围内，蛋白酶的酶活大于80%；浓度为5mM的不同金属离子对其活性的影响情况是：Na+、K+对酶活性没有影响，而Ca2+、Fe2+和Cu2+对酶活性具有抑制作用，但Mg2+、Mn2+和Ba2+对酶具有激活作用。 2.太平洋真鳕碎肉的基本成分：蛋白质18.71%，灰分0.80%，水分80.10%，粗脂肪0.46%。以水解度和可溶性钙结合量为评价指标，通过单因素试验和响应面设计试验优化水解条件。结果表明：胰蛋白酶和BP-1复合水解效果较好；最优水解条件为：pH8.22，温度54.7℃，水解时间5.1h，加酶量300U/g，料液比1:3，两酶比（胰蛋白酶：BP-1）为1:2，在此最优条件下，水解度为32.9%，可溶性钙结合量为23.30μg/mL。高效液相色谱分析结果表明，太平洋真鳕碎肉水解液中分子量大于1kDa的多肽组分占10.47%；分子量小于1kDa的多肽组分占89.53%，其中，分子量在0.13～0.52kDa的组分占总量的47%。 3.以螯合率为指标，优化了太平洋真鳕碎肉肽钙复合物制备工艺，并对其稳定性进行了初步研究。试验结果表明，终浓度为95%乙醇对太平洋真鳕肽钙复合物的沉淀效果最佳，最佳制备工艺条件为肽钙质量比3:1，温度43.6℃，时间50min，pH7.50，螯合率为78.69%。傅里叶红外光谱扫描结果显示，钙离子与太平洋真鳕碎肉多肽的氨基端和羧基端相结合。稳定性分析结果表明，太平洋真鳕碎肉肽钙复合物具有较高的抗消化性，经过胃肠道模拟消化后，持钙能力仍保留85.15%；具有较好的酸碱稳定性，在pH5~9时，钙保留率保持在80%以上。磷酸盐能够与肽钙复合物竞争钙离子，随着磷酸盐浓度的上升，钙离子的保留率显著下降（P＜0.05），当磷酸盐浓度为20mmol/L时，钙离子的保留率下降到15.40%。不同浓度乳糖和氯化钠对肽钙复合物的稳定性没有显著影响（P＞0.05）。 4.以单层细胞跨膜电阻(transepithelial electrical resistance，TEER)值和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP)活性为评价指标，构建Caco-2细胞单层模型，并研究太平洋真鳕肽钙复合物在Caco-2细胞单层模型中的转运情况。试验结果表明：当细胞培养15d时，单层细胞跨膜电阻已经达到500Ω?cm2，Caco-2细胞两侧碱性磷酸酶比值大于2；当培养21d时，单层细胞跨膜电阻达到615Ωcm2，Caco-2细胞两侧碱性磷酸酶比值大于5，说明Caco-2单层细胞已经形成致密、分化完全的单层细胞，建模成功，可用于模拟小肠消化吸收。Caco-2细胞钙转运吸收结果表明：在保留率方面，酪蛋白磷酸肽钙复合物（Caseinphosphopeptide calcium complex，CPP-Ca）最高，GMMP-Ca次之，无机钙最低，但三者之间差异不显著（P＞0.05）；转运率方面，无机钙的转运率最低，CPP-Ca的转运率高于GMMP-Ca但两者之间差异不显著（P＞0.05）；吸收率方面，CPP-Ca的吸收率最高，GMMP-Ca次之，无机钙最低，统计学分析三者差异显著（P＜0.05），说明太平洋真鳕碎肉肽钙复合物可以促进细胞水平钙离子的吸收。

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