普通生酮基古龙酸菌及其山梨糖脱氢酶的研究

摘要

在Vc两步发酵工艺中，第一步为醇糖转化，由醋酸菌(如氧化葡萄糖杆菌)转化D-山梨醇产生L-山梨糖；第二步是糖酸转化，由普通生酮基古龙酸菌(行业上俗称小菌)及其伴生菌(俗称大菌)组成的混合菌系将L-山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(KGA)。小菌为产酸菌，单独培养生长缓慢，需要在伴生菌的辅助下才能正常生长和产酸。 实验过程中发现了一种生长迅速且能从山梨糖产酸的菌株，我们称为快生小菌。通过菌株分离、分类鉴定和16S rDNA分析等方法，初步认定此菌为小菌和乙酸钙不动杆菌的融合株，此菌株传代过程中易丢失小菌的基因组转变成乙酸钙不动杆菌。我们利用穿梭质粒pWHl266做载体，构建了pWH1266-sdh，以乙酸钙不动杆菌做宿主尝试表达山梨糖脱氢酶SDH，没有检测到SDH活性，但质粒回转入大肠杆菌可以检测到SDH活性。 构建了pET-cytc、pGEX-KG-sdh质粒，表达并纯化了细胞色素C(cytC)和山梨糖脱氢酶(SDH)，并利用GST pull-down方法研究了SDH与cytC在体外的相互作用，发现二者之间存在结合作用，但实验重复性差，受多种因素影响。 分析了各种碱基、叶酸、二氢叶酸和大菌裂解液对小菌生长的影响。对大菌中促进小菌生长的物质进行了初步分离和鉴定，认定这种物质为热不稳定的大分子，可能是蛋白质。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一章快生小菌的分离鉴定及山梨糖脱氢酶的表达

材料与方法

1材料

2方法

结果

1快生产酸菌分离

2产酸快生小菌形态

3小菌、Y18A，Y18B抗生素敏感性检测

4 Y18A、Y18B和小菌全菌蛋白的比较

5 Y18A、Y18B和小菌山梨糖脱氢酶检测

6 Y18A、Y18B和小菌16S rDNA扩增序和列分析

7利用pWH1266质粒在快生小菌中表达山梨糖脱氢酶

讨论

第二章山梨糖脱氢酶相互作用蛋白的初步研究

材料与方法

1材料

2方法

结果

1 GST-SDH与Cytc-His体外相互作用的实验

2 His pull-down钓取小菌中与SDH相互作用蛋白

讨论

第三章小菌生长因子的研究

材料与方法

1材料

2方法

结果

1混合碱基对小菌生长的影响

2叶酸和二氢叶酸对小菌生长的影响

3大菌胞内组分对小菌生长的影响

讨论

总结

可产酸快生小菌的分离鉴定

参考文献

致谢