沙地云杉胚性细胞悬浮培养研究

摘要

本文以沙地云杉成熟合子胚为材料，诱导胚性愈伤组织，并继代培养，进而建立分散性好、活力高的悬浮细胞系。为进行沙地云杉的原生质体培养、基因导入及细胞融合等研究提供实验基础。 1、沙地云杉成熟合子胚诱导的愈伤组织类型有胚性与非胚性愈伤两种。质地松软，表面有光泽的愈伤为胚性愈伤，其余为非胚性愈伤。愈伤组织的诱导率比较高，大部分诱导率在60％以上，但没有添加激素的培养基上不产生愈伤。在2mg/L6—BA和1mg/L2，4—D的浓度配比下，达到最高诱导率，为93.75％。所有胚性愈伤组织在保持和增殖时出现了褐化现象，但是程度不一样：在不加任何激素时，愈伤组织褐化率为100％；在激素配比1mg/L6—BA和0.2mg/L2，4—D时愈伤组织褐化率最小，为16.67％；总体而言2，4—D浓度在0.1mg/L和0.2mg/L时愈伤组织褐化率小，6—BA和2，4—D一起附加时比单个附加时的愈伤组织褐化率小。同样，2，4—D浓度在0.1mg/L和0.2mg/L时愈伤组织胚性保持的好，6—BA和2，4—D一起附加时比单个附加时的愈伤组织胚性保持的好。 2、沙地云杉胚性细胞悬浮培养生长周期为12d，通过选择，最佳培养条件是：DCR+0.1mg/L2，4—D+1.0mg/L6—BA+30g/L蔗糖，pH6.0，接种量3.0％，摇床转速为110r/min，25±1℃、黑暗条件下震荡培养。 3、动力学研究过程中，细胞鲜重和干重的变化趋势是一致的，延迟期为第0～3d；对数生长期为4～8d；从第9d开始进入稳定期。细胞活力的OD值第4d时达到最大，为0.74；随后开始下降，到第10d时降到最小，为0.34；之后又有所回升。由细胞活力和干重变化曲线得出，继代周期为6～8d。在生长周期内，pH值一直在减小，第1～9d减小幅度比10～12d间要大。NH4+在培养过程中消耗最快，在第10d时已耗尽；总糖的消耗量在3～8d下降最快，NO3—和PO43—的消耗趋势与蔗糖的基本相同，只是总糖的消耗前期与后期比NO3—和PO43—的消耗要快。NO3—的减少率为63.79％，NH4+为100％，蔗糖和PO43—分别为80％和84.62％。由于缺少铵盐，细胞生长从第9d开始进入稳定期。 4、细胞活力与其它各参数之间在0.05和0.01检验水平下都不相关；而其余的各参数之间在0.01检验水平下都显著相关。细胞干重与其余的各参数之间的都呈负相关。除了细胞活力OD值外，其余个参数与细胞干重的相关系数都在—0.95以上。因此，培养液中不仅是总糖和其它营养元素直接影响细胞的增殖，培养液酸碱性也直接影响细胞的增殖。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略语表

声明

1前言

1.1植物细胞悬浮培养技术研究进展及意义

1.2裸子植物胚性愈伤诱导与保持影响因素

1.2.1外植体

1.2.2基因型

1.2.3植物激素

1.2.4其它因素

1.3林木树种悬浮系建立过程中的影响因素

1.3.1培养材料

1.3.2培养基成分

1.3.3培养条件和培养方式

1.4悬浮培养的动力学及各参数间的相关性研究

1.5试验的目的意义及内容

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1材料来源

2.1.2外植体处理

2.1.3沙地云杉愈伤组织的诱导及保持和增殖

2.1.4仪器和试剂

2.2试验方法

2.2.1悬浮培养系的建立与培养条件的选择优化

2.2.2参数的测定

2.2.3试验数据统计分析

3结果与分析

3.1沙地云杉胚性愈伤组织的诱导和增殖

3.1.1沙地云杉胚性愈伤组织诱导

3.1.2沙地云杉胚性愈伤组织保持

3.2沙地云杉胚性细胞悬浮培养系建立与培养条件选择优化

3.2.1生长周期测定

3.2.2基本培养基选择

3.3.3pH，碳源，转速及接种量对悬浮培养的影响

3.3.4最佳激素浓度配比选择

3.3沙地云杉胚性细胞悬浮培养过程动力学分析

3.3.1细胞鲜重和干重生长曲线

3.3.2细胞活力变化规律

3.3.3pH值的变化规律

3.3.4蔗糖、硝酸根、铵根、磷酸根离子的消耗

3.4悬浮培养过程中各参数间的相关性分析

4.讨论

4.1 2，4-D和6-BA的不同浓度组合对植物愈伤组织诱导影响

4.2 2，4-D和6-BA的不同浓度组合对植物胚性愈伤组织胚性保持影响

4.3建立植物胚性细胞悬浮培养系的影响因素

4.4植物胚性细胞悬浮培养体系的动力学研究

4.5植物胚性细胞悬浮培养过程中各参数的相关性

5结论

致 谢

参考文献

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