布鲁菌的分离鉴定及OMP25基因的克隆

摘要

布鲁菌病是由布鲁菌引起的人、畜共患传染病。在内蒙古地区流行较久，危害严重。本试验采集流产牛、羊胎儿的病料和布鲁菌病血清学检测阳性奶牛的牛乳进行病原分离与鉴定。经过分离培养、涂片、生化试验以及玻片凝集试验，共分离出布鲁菌4株。采用CO2需求、H2S产生、染料抑制、单因子血清、噬菌体裂解等试验对这4株菌进行了种型鉴定。鉴定结果发现4株菌中有3株为羊种生物3型，1株为牛种生物3型。为了弥补血清学和微生物学方法检测和诊断布鲁菌病的种种不足，本研究同时根据GeneBank上公开发表的布鲁菌外膜蛋白OMP25基因序列设计引物，用PCR方法对分离出的这两种型的布鲁菌和标准株分别扩增，提取OMP25基因并与T载体连接进行克隆。序列分析表明成功的克隆到目的基因，分离出的3株羊种菌之间同源性为100％，与Brucella melitensis的同源性为99.8％。牛种分离菌与Brucella abortus的同源性为99.5％。该基因的克隆对布鲁菌病的检疫及快速诊断具有十分重要的意义。

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1 引言

1.1布鲁菌的病原学

1.1.1布鲁菌形态特征及生化特性

1.1.2 布鲁菌基因组

1.1.3 布鲁菌分类分型

1.1.4 布鲁菌的抵抗力与致病力

1.1.5 布鲁菌抗原

1.1.6 布鲁菌病的致病机理与病理变化

1.1.7 布鲁菌病的临床症状

1.1.8 防制

1.2 布鲁菌检测方法的研究进展

1.2.1 细菌学方法

1.2.2 免疫学方法

1.2.3 聚合酶链反应(PCR)法

1.2.4 核酸探针检测

1.3 布鲁菌疫苗的研究进展

1.4 布鲁菌主要的外膜蛋白

1.5 研究的目的意义

2 布鲁菌的分离鉴定

2.1 材料

2.1.1 被检材料

2.1.2 血清

2.1.3 菌株

2.1.4 培养基

2.1.5 主要试剂及溶液

2.1.6 仪器设备

2.2 方法

2.2.1 分离培养

2.2.2 染色镜检

2.2.3 玻片凝集试验

2.2.4 生化试验

2.2.5 种型鉴定

2.3 结果

2.4讨论

3 布鲁菌OMP25的克隆

3.1 实验材料

3.1.1 菌株和载体

3.1.2 试剂

3.1.3 主要仪器和设备

3.2 实验方法

3.2.1 引物的设计

3.2.2 布鲁菌基因组的提取

3.2.3 目的片段的扩增

3.2.4 PCR产物的回收、纯化

3.2.5 目的片段与T载体的连接

3.2.6 连接产物的转化

3.2.7 转化菌的蓝白斑筛选

3.2.8 转化菌的菌液PCR鉴定

3.2.9 转化菌重组质粒的提取

3.2.10 重组质粒的双酶切鉴定

3.2.11 重组质粒的DNA序列测定与分析

3.3 结果

3.3.1 DNA模板的制备

3.3.2 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果

3.3.3 PCR产物胶回收电泳

3.3.4 重组质粒的蓝白斑筛选

3.3.5 重组质粒的双酶切鉴定

3.3.6重组质粒的序列测定与分析

3.4 讨论

4 结论

致谢

参考文献

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