亚治疗剂量四环素饲喂对牛源微生物耐药基因的影响

摘要

以低于治疗水平的氯四环素(CT)，以及低于治疗水平的氯四环素和治疗水平的氧四环素组合(CT-OX)两种方式分别对肉牛进行抗生素处理，研究其对肠道大肠杆菌耐药基因型的影响。粪便样品采自商业肉牛饲养场，并有详实的抗生素使用历史记录，通过抗菌药物纸片法和稀释法敏感性试验测试分离出的大肠杆菌对四环素、氧四环素和氯四环素的敏感性。利用tet(A)，tet(B)和tet(C)基因的引物进行多重PCR试验，检测对四环素耐药或中介的细菌样品(176个)，结果发现全部样品均携带一种或者两种耐药基因，tet(A)在两组样品中的流行基本相同，但CT组中tet(B)的流行比例较CT-OX组小(P<0.05)，而tet(C)的流行比例则较大(P<0.05)。同时，在对四环素表现为中介的样品(52个)检测结果中，发现其中92.3％呈现出携带tet(C)基因。另外，最小抑菌浓度值(MICs)结果表明，药物敏感性同时取决于四环素类别和耐药基因型两方面的因素。利用real-time PCR在转录水平上分析tet(C)基因，发现耐药型与中介型并非上游调控造成。但是，对tet(C)基因的测序分析发现耐药型的第1063处碱基由T突变为G。由上述数据可以看出，对肉牛的四环素饲喂种类可以影响到大肠杆菌的耐药基因流行。
　　将肉牛分为亚治疗剂量氯四环素的饲喂组及其对照组，在对其处理60天后进行粪便与咽部分泌物样品的采集，且对另一部分肉牛进行饲喂前后同一动物的样品采集，提取其宏基因组 DNA，研究其中四环素耐药基因、磺胺耐药基因和红霉素耐药基因的浓度变化。结果表明，亚治疗剂量四环素的饲喂对tet(B)基因浓度的影响是显著的，四环素的存在的确对该基因的存在产生了选择压力；粪便中携带tet(C)基因的大肠杆菌数目较少，因此 tet(C)基因在粪便中的浓度相对较低；咽部分泌物中 tet(H)基因浓度较高；四环素处理同样对tet(M)、tet(O)和tet(W)基因的选择压力也是明显的，而粪便样品中这4类基因的浓度较高。对于磺胺耐药基因来说，sul2基因在粪便样品中表现出了较高的浓度。在红霉素耐药基因中，亚治疗剂量四环素的饲喂对 erm(A)和erm(X)基因的影响是较为显著的。
　　通过对肉牛给予低于治疗水平的不同种类抗生素，研究其对废弃粪便微生物群落中四环素耐药基因数量与持久性的影响。试验肉牛被分成不同的抗生素处理组：氯四环素组，氯四环素和磺胺甲嘧啶组，以及对照组。将每个围栏中所有动物的新鲜粪便混匀为一份混合样品作为模式样品(每个处理组3份)，分别在露天放置的第7、14、28、42、56、70、84、98、112、126和175天时采样并提取DNA，利用real-time PCR方法测定四环素耐药基因tet(B)，tet(C)，tet(L)，tet(M)，tet(W)以及16S-rRNA的浓度。结果显示，16S-rRNA的浓度在不同处理间相似，在56天内保持增加(P<0.05)；总体上看，四环素组的耐药基因初始浓度较高(P<0.05)；所有处理组的tet(B)和tet(C)浓度到56天时均增长了1～2个对数级，到175天时又降低到初始水平，而tet(M)与tet(W)的浓度与其他耐药基因相比较高。由此可见，四环素耐药基因可以在废弃粪便中持续存在超过175天，而某些基因的最初数量可能会导致错估其后的变化，其浓度的暂时改变并不能归因于微生物群落数量的变化。

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1 引言

1.1 亚治疗剂量抗生素在畜牧生产中的应用及其影响

1.2 肉牛生产系统中细菌耐药性的研究进展

1.3 细菌耐药性产生的遗传机制及作用机理

1.4 四环素耐药基因研究概况

1.5 本研究的内容与意义

2 不同四环素耐药基因型大肠杆菌对四环素类抗生素的耐药性分析

2.1 试验材料与方法

2.2 试验结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

3 四环素饲喂对肉牛肠道及咽部微生物耐药基因的影响

3.1 试验材料与方法

3.2 试验结果

3.3 讨论

3.4 小结

4 肉牛废弃粪便中四环素耐药基因持久性的研究

4.1 试验材料与方法

4.2 试验结果

4.3 讨论

4.4 小结

5 结论

致谢

参考文献

作 者 简 介