双重荧光定量RT-PCR检测猪O型口蹄疫病毒GX和XJ株方法的建立及应用

摘要

本研究根据口蹄疫病毒O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株VP1基因序列设计合成1对通用引物和2个Taqman探针。通过制备GX与XJ株标准品RNA，优化反应条件，建立双重荧光定量RT－PCR，并评价其灵敏性，特异性、重复性。利用建立的双重荧光定量RT－PCR检测方法对猪O型FMD疫苗中的GX和XJ株进行鉴别检测，以及对疫苗中病毒RNA含量进行定量测定。结果显示，检测GX与XJ株双重定量RT-PCR标准曲线的相关系数分别为R2=0.997和R2=0.995；建立的双重荧光定量RT-PCR方法能够同时鉴别检测灭活病毒中口蹄疫病毒不同基因型，具有良好的特异性与灵敏性；RNA含量最低检测限为10拷贝/μL。应用此方法能够满足对企业生产车间的不同批次口蹄疫灭活病毒和种毒的RNA含量进行有效的检测，还可用于种毒的纯化检验，并且为疫苗的生产质量控制提供了一种新的检测方法。

目录

缩 略 语 表

1 引言

1.1 口蹄疫概述

1.1.1 病毒基本特征

1.1.2 基因组结构及其功能

1.1.3 FMDV的多型性和易变性

1.1.4 流行病学

1.1.5 临床症状

1.1.6 国内外流行情况及危害

1.1.7 口蹄疫诊断技术

1.1.8 口蹄疫疫苗研究进展

1.2 研究目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 病毒

2.1.2 试剂与仪器

2.1.3 引物与探针

2.2.1 标准品RNA的制备

2.2.2 单项实时荧光定量RT-PCR扩增及标准曲线的制备

2.2.3 单项实时荧光定量检测方法的灵敏性

2.2.4 单项实时荧光定量检测方法的特异性

2.2.5 双重实时荧光定量退火温度的优化

2.2.6 双重实时荧光定量RT-PCR扩增及标准曲线的制备

2.2.7 双重实时荧光定量检测方法的灵敏性

2.2.8 双重实时荧光定量检测方法的特异性

2.2.9 双重实时荧光定量检测方法的重复性

2.2.10 双重实时荧光定量检测方法的应用

3 结果

3.1 标准品RNA制备结果

3.2 单项实时荧光定量方法扩增曲线与标准曲线

3.3 单项实时荧光定量检测方法的灵敏性结果

3.4 单项实时荧光定量检测方法的特异性结果

3.5 双重实时荧光定量退火温度的优化结果

3.6 双重实时荧光定量RT-PCR扩增曲线与标准曲线

3.7 双重实时荧光定量检测方法的灵敏性结果

3.8 双重实时荧光定量检测方法的特异性结果

3.9 双重实时荧光定量检测方法的重复性结果

3.10 双重实时荧光定量检测方法的应用

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

作 者 简 介