AAPH诱导小鼠早期胚胎氧化应激的分子机制及谷胱甘肽抗氧化作用的研究

摘要

近几年随着技术水平的不断提高，体外受精技术被广泛应用于优良性状家畜胚胎的规模化生产、人类不孕不育的治疗等方面。尽管研究者对于培养液的改良、培养条件的优化做了大量的工作，由于不能完全模拟体内的受精环境，因此体外培养条件仍难达到与体内相当的胚胎发育率。研究表明，活性氧(reactive oxygen species，ROS)是影响胚胎体外发育的重要因素，但对于活性氧影响胚胎质量的分子机理仍知之甚少。本研究就活性氧诱导剂AAPH诱导小鼠早期胚胎氧化应激的分子机制及抗氧化剂谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的恢复作用进行了研究。
　　一、AAPH对小鼠早期胚胎的影响及其分子机制
　　1、采用浓度为0.1、1.0、1.5、2.0mM的AAPH分别处理受精卵和2-细胞胚胎。结果表明，1.5mM AAPH处理受精卵24h后，全部胚胎发生2-细胞阻滞，在48h后出现大量死亡的现象。处理2-细胞24h后，也全部停滞在2-细胞期。因此，本实验选择处理条件为1.5mM、处理时间24h的受精卵作为研究对象。利用DCFH-DA荧光探针进行ROS检测，同时利用实时荧光定量PCR检测活性氧相关基因（Gpx4、Gpx6、Prdx2)的表达。结果显示，处理组的活性氧水平显著升高(P＜0.05)，并且Gpx6、Prdx2的表达量显著高于对照组，而Gpx4的表达量显著低于对照组(P＜0.05)。表明氧化应激模型构建成功。
　　2、JC-1染色、凋亡及其相关基因检测结果显示，处理组2-细胞胚胎的线粒体膜电位显著降低(P＜0.05)，凋亡相关基因（Bax、Caspase3、Caspase8、Caspase9）的表达均显著升高(P＜0.05)，并检测到早期凋亡信号。合子基因组激活相关基因（Zscan4d、eIF-1A、Hspa1b、H2afz）的表达量均极显著降低(P＜0.01)。
　　二、GSH对AAPH处理后的早期胚胎发育的恢复及其作用机制
　　1、在1.5mM AAPH处理条件下，同时分别加入1、2、3mM的GSH分别处理受精卵和2-细胞胚胎。处理受精卵24h后，各浓度的GSH均不能使2-细胞胚胎突破阻滞，但能够显著提高第一次卵裂率。其中，2mM GSH处理后第一次卵裂率最高。处理2-细胞24h后，胚胎有部分能够突破2-细胞阻滞但均不能发育到囊胚阶段。因此，本实验选择处理条件为2mM GSH+1.5mM AAPH、处理时间24h的受精卵作为研究对象。DCFH-DA染色及活性氧相关基因检测结果显示，与对照相比，活性氧水平仍显著升高(P＜0.05)。
　　2、加入GSH后，线粒体膜电位显著升高(P＜0.05)，并且未检测到早期凋亡信号以及合子基因组激活相关基因表达的恢复。
　　3、低浓度AAPH(0.5mM)处理受精卵后，只有8％的受精卵能发育到4-细胞，加入GSH后有23.7％能够发育到4-细胞，显著降低了胚胎的阻滞率(P＜0.05)，提高了胚胎的发育率，但胚胎仍不能发育到囊胚阶段。
　　综上所述，较高浓度的AAPH会引起活性氧水平的升高，从而产生氧化应激，进而引起线粒体膜电位的降低，诱发细胞凋亡，使小鼠胚胎发育阻滞在2-细胞阶段，抑制了合子基因组的激活。而GSH在高水平的活性氧条件下不能使胚胎突破发育阻滞，但在低水平活性氧条件下可以降低胚胎的阻滞率，提高胚胎的发育率。本研究初步分析了活性氧影响早期胚胎发育过程的分子机理，为下一步深入研究活性氧的相关机制奠定了工作基础，同时为哺乳动物体外受精培养体系的优化提供了理论依据。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 综述部分 活性氧在胚胎发育中的研究进展

1 活性氧的产生和清除

2 活性氧作用的分子机制

3 活性氧对哺乳动物胚胎发育的影响

4 总结

参考文献

第二部分 实验研究部分

第一章 AAPH对植入前小鼠早期胚胎的影响及其分子机制

引言

材料与方法

结果

讨论

第二章 谷胱甘肽对AAPH处理后的早期胚胎发育的影响及其作用机制的研究

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

结论

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文