小鼠原始生殖细胞迁移中的基因表达及调节通路分析

摘要

原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）是雌雄生殖细胞的前体细胞，小鼠PGCs（mouse PGCs,mPGCs）是由早期着床后胚胎的上胚层细胞受来自胚外信号的作用特化而成，PGCs特化后经迁移到达生殖嵴参与性腺发生。PGCs的迁移过程受多因素调控，但目前对参与调节的分子及作用机制还缺乏了解。
　　本研究首先利用流式细胞法从OCT-4标记的小鼠胚胎分离获得9.5天（embryo day9.5,E9.5）和12.5天（E12.5）的mPGCs两组样品分别代表迁移阶段和迁移到达生殖嵴阶段，其中，为排除性别分化对迁移基因调控的影响，E12.5天分为雌雄两组。随后，利用hiseq4000测序平台结合PE101测序方法对获得的细胞进行单细胞表达谱测序（RNA Sequencing,RNA-seq）分析。测序结果共获得13,977个转录本，其中9,822个属于已知蛋白编码基因的转录本，1,048个属于未知的转录本。在表达谱测序结果比较中，E9.5天与雌性E12.5天（E12.5F）mPGCs有7,395个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs），其中包括上调基因4,792个和下调基因2,603个（FDR≤0.001且变化倍数≥2）。E9.5天与雄性E12.5天（E12.5M）mPGCs相比，共检测到7,289个DEGs，包括4,287个上调基因和3,002个下调基因。为验证测序结果的准确性，随机挑选26个mRNA差异表达基因进行实时荧光定量分析，结果显示与RNA-seq得到的基因表达差异趋势一致，表明RNA-seq测序结果可靠。
　　为阐明mPGCs迁移过程中的调控网络，通过表达基因通路（pathway）分析发现，测序所获得的DEGs中有75个通路在Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库中被注释（P＜0.01）。通过比较，在雌性mPGCs迁移过程中涉及56个信号通路；在雄性中，涉及56个信号通路。其中37个信号通路是雌性和雄性mPGCs迁移过程中共同拥有的，这些通路涉及细胞存活15个，细胞增殖14个，细胞粘附7个，细胞迁移5个和细胞分化3个。其中ErbBs信号通路位于上述所有类型的信号通路中。通过对ErbBs信号通路以及其上下游调控通络的分析，表明上游Ras信号通路，EGFR酪氨酸激酶抑制剂阻断信号通路和下游Focal adhesion信号通路同时发生改变。并对涉及这些通路的LRRC58和RHOA蛋白进行免疫荧光分析和8个基因进行qPCR验证，验证结果与分析结果相符。因此，表明ErbBs信号通路可能在mPGCs迁移过程中发挥作用。
　　本研究通过对mPGCs迁移过程的基因表达谱解析，为进一步深入研究mPGCs的迁移机制及阐明小鼠配子发生和分化过程奠定了基础。

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