下丘脑正中视前核(MnPO)TRPV4对急性冷暴露过程中大鼠BAT产热的影响

摘要

瞬时感受器电位(transient receptor potential,TRP)是近年来发现的主要与感受功能有关的膜通道蛋白家族,主要包括TRPC、TRPV、TRPM等。TRPV4(又称VR-OAC、VRL2或oTRPC4)是TRPV家族成员之一,具有温控特性,可被27℃以上的温热刺激激活,并可产生较强的钙离子内流。
　　 Nilius B等研究表明在哺乳动物组织中,TRPV4主要存在于心脏、大脑、内皮等许多部位。最近的研究显示,在体温调节中枢下丘脑的正中视的核(median preoptic nucleus,MnPO)和视前内侧核(medial preoptic nucleus,MPO)发现有TRPV4的表达。机体正常体温的维持是在体温调节中枢的调控下,产热和散热过程处于平衡状态。褐色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)在哺乳动物体内主要参与非寒战性产热,其产热过程主要受下丘脑的调节,尤其是MnPO和MPO参与的调节作用。
　　 如前所述,在MnPO存在有TRPV4的表达,但其确切的生理功能还不明确。Koii Shibasaki等研究证明,在海马神经元中存在的TRPV4通过影响其神经元静息电位水平,调控海马神经元的兴奋性,进而,影响海马神经元的功能活动。本实验室以往的研究提示,下丘脑中的TRPV4参与维持正常体温和LPS致大鼠发热过程。
　　 目的：为进一步探讨下丘脑MnPO中TRPV4参与体温调节的作用,本实验应用TRPV4激动剂4αPDD和阻断剂RN1734,观察了MnPO中TRPV4对寒冷暴露下大鼠体温及BAT产热活动的影响。
　　 方法：
　　 1、实验动物及处理
　　 (1)实验动物及分组
　　 选用健康雄性SD大鼠,体重220～250g,基础体温(38.1±0.2)℃,由中国医科大学实验动物中心提供。将动物随机分为6组:正常对照组(N)、单纯冷暴露组(C)、4αPDD组(P)、4αPDD+冷暴露组(P+C)、RN1734组(R)、RN1734+冷暴露组(R+C)。
　　 (2)大鼠MnPO插管和体温测量发射子植入
　　 下丘脑MnPO插管:将大鼠用10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉,然后将其头部固定于立体定位仪上,暴露前囟。参照大鼠脑图谱,向下丘脑MnPO(B:0mm,L/R:1mm,H:7mm)与矢状面成10°夹角,插入-不锈钢管,并留置与之相匹配的针芯,用牙托水加牙科水泥固定。
　　 实验结束后,检测插管位置:在MnPO中微量注射液体染料亚甲蓝1ul。随后用4％多聚甲醛经大鼠心脏灌流,取出经多聚甲醛固定的大脑。将其置于30％蔗糖溶液中脱水后,制备冰冻切片,显微镜下观察插管位置。
　　 体温测量发射子植入:在麻醉状态下,在大鼠腹腔植入遥测系统发射子。术后动物单笼饲养,恢复一周后进行实验。
　　 2、体温测量
　　 应用BW-200生理无线遥测系统测量大鼠体温。实验前一日早上8时开始记录大鼠基础体温,每隔30分钟测量体温1次,共测量6小时,取其平均值记为基础体温。实验均在早8时开始,各组在相应处理后开始监测体温变化,每隔5分钟自动记录体温一次,直到实验结束。
　　 3、下丘脑MnPO细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)测定
　　 采用日立F-4500型荧光双波长分光光度计测定。
　　 4、下丘脑MnP0中TRPV4表达测定
　　 (1)Western blot检测下丘脑MnPO中TRPV4表达。对照选用抗β-肌动蛋白抗体(β-actin)。目的蛋白与相应β-actin蛋白的狄度比值作为该目的蛋白的相对表达量。
　　 (2)免疫荧光检测下丘脑MnPO中TRPV4表达,荧光显微镜下观察并摄片。
　　 5、BAT组织中UCPl mRNA表达测定
　　 RT-PCR检测BAT组织UCP1 mRNA表达。扩增片段的长度为478bp。PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳后,用凝胶成像分析系统进行基因表达水平分析。
　　 6、大鼠BAT质量及BAT总蛋白含量测定
　　 用Folin-酚法,以牛血清蛋白为标准,采用分光光度计测定BAT样品中的总蛋白质的浓度。
　　 7、BAT中线粒体蛋白含量检测
　　 提取BAT中线粒体,线粒体蛋白质定量用Folin-酚法,以牛血清蛋白为标准,采用分光光度计测定。
　　 8、大鼠BAT中细胞色素C氧化酶(COX)活性检测
　　 使用COX活性检测试剂盒(GENMED,USA)检测COX活性。
　　 9、数据分析
　　 所有实验数据均用均数士标准差(x±s)表示,各组均数间差异的比较应用t检验,相关分析用相关性检验分析法。
　　 结果：
　　 与对照组(N)比较,单纯给予TRPV4特异性拮抗剂RNl734组(R),体温无明显变化;BAT质量、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量、UCP-1mRNA表达量、细胞色素C氧化酶活性也无明显变化;MnPO中TRPV4表达降低,细胞内钙离子浓度降低。单纯给予TRPV4特异性激动剂4αPDD组(P),体温明显升高;BAT质量、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量明显降低,UCP-1mRNA表达量、细胞色素C氧化酶活性明显升高;MnPO中TRPV4表达升高,细胞内钙离子浓度升高。
　　 与对照组(N)比较,单纯冷暴露组(C)的体温下降且有统计学意义;BAT质量减少、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量减少、UCP-1mRNA表达量增加、细胞色素C氧化酶活性增加;MnPO中TRPV4表达增加,细胞内钙离子浓度升高。
　　 与单纯冷暴露组(C)比较,预先给予RNl734+冷暴露组(R+C),冷暴露时体温明显下降;BAT质量减少、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量减少的幅度低于单纯冷暴露组(C);MnPO中TRPV4蛋白表达减少,细胞内钙离子浓度升高幅度低于单纯冷暴露组。预先给予4αPDD+冷暴露组(P+C),冷暴露体温无明显下降,且略有升高;BAT质量减少、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量减少的幅度高于单纯冷暴露组(C);MnPO中TRPV4蛋白表达增加,细胞内钙离子浓度增加明显。
　　 结论：
　　 1、TRPV4特异性激动剂4αPDD或特异性阻断剂RN1734,能分别诱导或抑制通道的在细胞膜上的表达。
　　 2、在下丘脑MnPO区给予4αPDD或RN1734,分别能增加或减少细胞内钙离子浓度。
　　 3、在寒冷环境下,下丘脑MnPO中给予4αPDD或RN1734,分别能增强或减弱BAT产热活动。