MiR-1275通过上调IGF-1R及CCR7的表达从而促进头颈鳞癌的增殖、迁移及侵袭能力

摘要

目的：头颈鳞癌是头颈部常见的起源于皮肤及黏膜上皮衬里的高侵袭性恶性肿瘤。由于头颈鳞癌在肿瘤生物学行为上具有的强局部侵袭能力及易向周围及远处淋巴结转移的特点，导致了头颈鳞癌患者预后较差，使其总体五年生存率持续较低。近些年来，随着有关于头颈鳞癌中异常表达的miRNA与头颈鳞癌发生发展关系的研究报道大量出现，为我们深入了解头颈鳞癌发生发展的分子机制提供了巨大帮助。但是对于一些miRNA在头颈鳞癌中发挥的具体作用及作用方式，我们的了解仍然具有一定的局限性。miRNA是非编码蛋白质的单链小RNA分子，它可以与目标mRNA的3'端非编码区域结合发挥作用，通过降解目标mRNA或抑制mRNA的翻译从而调控基因的表达量。已证明miRNA可以参与许多疾病的发展过程，特别是恶性肿瘤。然而，目前虽然已有许多研究证实了在多种疾病中miR-1275的表达量异常，但是有关于miR-1275在头颈鳞癌发生发展过程中起何种作用的信息仍十分有限，因此miR-1275在恶性肿瘤特别是头颈鳞癌中发挥的具体作用及作用方式还需要我们进一步的研究。IGF-1R在已发表的研究中被证明在头颈鳞癌中高表达，且通过实验验证了其在头颈鳞癌细胞中可以通过激活PI3K/AKT信号通路从而提高头颈鳞癌的转移能力。课题组在之前的研究中发现了CCR7在头颈鳞癌中的高表达趋势，证明CCR7同样可以激活PI3K/AKT信号通路从而参与调控头颈鳞癌的淋巴结转移过程。PI3K/AKT信号通路在头颈鳞癌的发生发展过程中所起到的重要作用已经被研究者广泛认同。
　　方法：⑴使用实时荧光定量PCR技术(Real Time PCR)检测头颈鳞癌病灶组织及头颈鳞癌细胞中miR-1275的表达量。⑵利用从TCGA数据库中获取的头颈鳞癌患者的临床数据以及他们的miR-1275表达谱数据，对表达有miR-1275的头颈鳞癌患者进行生存分析。⑶使用能够过表达miR-1275的mimics质粒及能够抑制miR-1275表达的inhibitor片段，通过瞬时转染技术将它们导入头颈鳞癌细胞，达到调控头颈鳞癌细胞中miR-1275表达量的目的。通过细胞功能实验（划痕实验、Transwell实验和CCK8实验）验证miR-1275在头颈鳞癌细胞中所起的作用。各项实验按照研究目的均分为五组，即空白对照组、miR-1275过表达组、过表达阴性对照组、miR-1275抑制表达组及抑制表达阴性对照组。⑷利用Western blot实验检测转染mimics质粒及inhibitor片段后的头颈鳞癌细胞中预测靶基因的蛋白表达量的变化情况。
　　结果：①在15对头颈鳞癌临床标本的实时荧光定量PCR检测数据结果中（取自15名患者，其中15例头颈鳞癌病灶组织，15例对应的癌旁正常组织），我们发现了相较于癌旁正常组织，头颈鳞癌病灶组织中的miR-1275表达量有所上调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。依据头颈鳞癌细胞的实时荧光定量PCR数据结果显示，miR-1275在PCI-37A/37B及PCI-4A/4B四种头颈鳞癌细胞中均可被检测出（A:取自于头颈鳞癌患者的原发病灶，B:取自于同一患者的转移淋巴结组织）。其中PCI-37B中miR-1275的表达量显著高于PCI-37A，而PCI-4B中的miR-1275表达量也同样高于PCI-4A，以上差异均有统计学意义(P＜0.05)。我们依据这些数据结果推断miR-1275在头颈鳞癌的发生发展过程中可能起到了重要作用。②使用过表达miR-1275的mimics质粒、抑制miR-1275表达的inhibitor片段以及它们各自对应的阴性对照，分别转染头颈鳞癌细胞（PCI-37B）。利用实时荧光定量PCR技术，证实了分别转染过表达质粒及抑制表达片段后的头颈鳞癌细胞中miR-1275的表达量显著上升和下调，转染阴性对照的两组头颈鳞癌细胞中的miR-1275表达量无明显改变。③通过CCK8实验验证miR-1275对头颈鳞癌细胞增殖能力的影响，依据CCK8实验的结果数据制成标准曲线。按照标准曲线趋势得出结论，抑制头颈鳞癌细胞中miR-1275的表达可以降低细胞的增殖能力，增加细胞中miR-1275的表达量可以促进细胞的增殖能力。证明miR-1275可以促进头颈鳞癌细胞的增殖能力。④通过划痕实验及transwell迁移实验检测转染后的头颈鳞癌细胞迁移能力的改变。抑制头颈鳞癌细胞中miR-1275的表达量后，可以发现细胞的迁移能力显著降低;而上调miR-1275的表达量后，细胞迁移能力则显著提升。结果证明了miR-1275的表达量与头颈鳞癌细胞的迁移能力呈正相关趋势。⑤使用Transwell侵袭实验探究miR-1275对头颈鳞癌细胞侵袭能力的影响。可以发现抑制头颈鳞癌细胞中miR-1275的表达量后，细胞的侵袭能力显著下降;而上调细胞中miR-1275表达量后，细胞的侵袭能力显著上升。这说明miR-1275可以促进头颈鳞癌细胞的侵袭能力。⑥从TCGA数据库中查询到头颈鳞癌患者的临床数据以及其miR-1275的表达谱数据。利用ROC曲线获得分组临界值，根据该值将表达有miR-1275的头颈鳞癌患者分为两组。制作KM曲线并使用Log Rank检验获取显著性P值。我们发现了这样的趋势，即miR-1275表达量低的头颈鳞癌患者生存时间长于miR-1275表达量高的患者。⑦为了明确miR-1275参与头颈鳞癌转移过程的作用机制，我们利用Westernblot实验检测miR-1275能否通过调控IGF-1R及CCR7的蛋白表达量，参与调控头颈鳞癌的发生发展过程。通过转染技术抑制头颈鳞癌细胞中miR-1275的表达量后，我们发现IGF-1R及CCR7的蛋白表达量显著下降;而上调miR-1275的表达量后，IGF-1R及CCR7的蛋白表达量显著提高。据此我们可以合理推测，miR-1275可以通过增加IGF-1R及CCR7的蛋白表达量从而促进头颈鳞癌细胞的迁移、侵袭及增殖能力。
　　结论：⑴相较于癌旁正常组织及转移能力低的头颈鳞癌细胞，miR-1275在头颈鳞癌病灶组织及转移能力高的头颈鳞癌细胞中表达量有所上调。⑵生存分析结果提示，miR-1275表达量低的头颈鳞癌患者的生存时间可能更长。⑶miR-1275可以起到类似于癌基因的作用从而促进头颈鳞癌细胞的侵袭、迁移及增殖能力。⑷miR-1275可能通过直接或间接的作用方式上调IGF-1R及CCR7的蛋白表达量从而在头颈鳞癌中起到类似癌基因的作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：miR-1275在头颈鳞癌中的表达情况及临床意义

1 前言

2 实验材料、试剂和方法

2．1 细胞系及组织样本

2．2 主要试剂及耗材

2．3 主要仪器

2．4 实验方法

3 实验结果

3．2 Real Time PCR对头颈鳞癌组织与癌旁正常组织中hsa-miR-1275的表达量进行初步检测

3．3 Real Time PCR检测头颈鳞癌细胞中hsa-miR-1275的表达量

3．4 分析头颈鳞癌患者不同表达水平的miR-1275与生存时间的关系

4 讨论

5 结论

第二部分：miR-1275对头颈鳞癌增殖、迁移及侵袭能力的影响及机制研究

6 前言

7 实验材料、试剂和方法

7．1 细胞系

7．2 主要试剂及耗材

7．3 主要仪器

7．4 实验方法

8 实验结果

8．1 瞬时转染后PCI-37B中hsa-miR-1275的相对表达量变化

8．2 Hsa-miR-1275对头颈鳞癌细胞的增殖能力的影响

8．3 Hsa-miR-1275对头颈鳞癌细胞的迁移能力的影响

8．4 Hsa-miR-1275对头颈鳞癌细胞的侵袭能力的影响

8．5 生物信息学软件预测IGF-1R可能是hsa-miR-1275的靶基因

8．6 Hsa-miR-1275通过何种作用方式促进了头颈鳞癌细胞的侵袭、迁移及增殖能力

9 讨论

10 结论

本研究创新性自我评价

参考文献

综述 miRNA在头颈鳞状细胞癌中所起作用的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历