先天性脊柱裂脊髓组织差异表达蛋白质筛选及CRMP-4沉默联合MSCs移植对脊柱裂胎鼠治疗作用的研究

摘要

目的：
　　应用维甲酸在大鼠神经管闭合的关键期(E10)给药，建立脊柱裂大鼠模型，以脊柱裂胎鼠的脊髓组织为主要研究对象，应用双向电泳和质谱分析技术分离鉴定孕17天的脊柱裂胎鼠脊髓组织与正常大鼠的差异蛋白质，并采用Realtime RT-PCR方法、Westemblot方法、免疫组化方法，在基因水平和蛋白水平观察在不同胚胎发育期正常对照组和脊柱裂组脊髓中差异蛋白质CRMP-4的表达情况，以探讨CRMP-4在不同胚胎发育期的表达规律。利用课题组前期研究结果，构建RNAi沉默CRMP-4载体，在宫内移植MSCs的同时，将包装有CRMP-4RNAi载体的腺病毒导入至16天胎鼠的脊柱裂1缺损部位，观察RNAi沉默CRMP-4联合MSCs移植对先天性脊柱裂神经修复的作用，探讨CRMP-4在先天性脊柱裂治疗中的作用机制。
　　方法：
　　1、动物模型建立与标本收集
　　2、双向电泳及质谱分析
　　3、Western blot方法验证差异蛋白质在脊髓组织中的表达
　　4、Real time RT-PCR检测不同胚胎发育时脊髓组织CRMP-4基因的表达
　　5、免疫组化
　　取4％多聚甲醛固定的脊髓标本各3例，进行石蜡切片。石蜡切片脱蜡、复水;3％H2O2，室温20min;L.A.B.抗原修复，60℃，20min;10％血清封闭，室温30min;一抗(兔抗大鼠CRMP-4，1∶1000)4℃，过夜;生物素化山羊抗兔二抗IgG，室温15min;滴加SABC复合物，室温20min;DAB显色;脱水、封片。应用图像分析仪(MPIAS-1000)测量和计算脊柱裂组与对照组不同胚胎发育期CRMP-4阳性区域光密度平均值。
　　6、骨髓间充质干细胞的培养、转染及rAd-eGFP-CRMP-4RNAi腺病毒载体的制备
　　7、显性脊柱裂胎鼠缺损脊髓内注射MSCs及重组病毒
　　8、Real-time PCR检测MSCs及CRMP-4RNAi注射后脊髓组织中各种因子表达情况
　　结果：
　　1、先天性脊柱裂大鼠模型
　　维甲酸150mg/kg给药成功制作先天性脊柱裂大鼠动物模型，胚胎不同期(E11、E12、E13、E15、E17、E21(P0))共剖检获取胎鼠231只，其中脊柱裂186只(80.1％)，剖取正常对照组胎鼠100只。
　　2、双向电泳及质谱分析结果
　　脊柱裂组和对照组胎鼠脊髓组织的蛋白质经双向电泳分离，通过Image Master2D Platinum6.0图像分析软件分析，同一样本3张胶蛋白质斑点匹配率大于80％，胶体考染获得的可识别斑点数为813±51个，其中对照组825±69个，脊柱裂组802±36个。经质谱分析确定有13种差异蛋白质，其中表达上调蛋白5种，包括坍塌反应调节蛋白4(CRMP-4)、血清白蛋白前体(Serum albumin precursor)、不均一性核糖核蛋白H/F(hnRNPH/F)、60S酸性核糖体蛋白P0(60s acidic ribosomal protein p0)和蛋白二硫化物异构酶A3(Pdia3)，表达下调蛋白8种，包括14-3-3蛋白(14-3-3protein beta/alpha、zeta/delta、theta、epsilon)、蛋白二硫化物异构酶A6(Pdia6)、多萜基二磷酸寡聚糖蛋白葡糖基转移酶(DDOST48)、热休克蛋白70(Hsc70)、调宁蛋白(calponin)低表达，这些蛋白质参与信号转导、蛋白质折叠、转录调节和细胞凋亡、迁移等细胞诸多方面生命活动，可能与脊柱裂的发生有关。
　　3、Real time RT-PCR检测CRMP-4mRNA的表达结果
　　融解曲线显示目的基因扩增的特异性和Ct值的一致性良好。CRMP-4mRNA在胚胎发育不同期(E11、E12、E13、E15、E17、E21(P0))的正常对照和脊柱裂胎鼠的脊髓组织中均有表达，呈现先上调后下调的总趋势，其峰值均出现于E17。在脊柱裂组，CRMP-4mRNA在不同胚胎发育期E12、E13、E15、E17、E21(P0)的表达水平均显著高于相应对照组(P＜0.05)。
　　4、Western blot结果
　　对表达下调蛋白14-3-3ε和表达上调蛋白CRMP-4进行western blot验证，结果显示其在脊柱裂组和对照组脊髓组织中的表达趋势与双向电泳结果一致。
　　在正常对照组和脊柱裂组脊髓中CRMP-4蛋白表达均出现于E12，并在之后的不同胚胎发育期都有表达，CRMP-4蛋白的表达均呈现上调的总趋势。在不同胚胎发育期脊柱裂组CRMP-4蛋白的表达水平显著高于正常对照组(P＜0.05)。
　　5、免疫组化CRMP-4蛋白的表达结果
　　CRMP-4蛋白在正常对照组和脊柱裂组胎鼠脊髓中呈不同程度的阳性着色，主要分布于脊髓白质区和背根神经节。在不同胚胎发育期脊柱裂组CRMP-4蛋白的表达水平显著高于正常对照组(P＜0.05)。
　　6、脊柱裂胎鼠缺损脊髓内注射MSCs及CRMP-4RNAi后，脊髓中相关基因mRNA的表达
　　在MSCs+CRMP-4RNAi联合注射组和CRMP-4RNAi注射组凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-9均有显著下调，Bcl2、Bax在各组无明显变化;微管相关基因Tau、Map-2及突触相关基因Synaptin-1、synaptotagmin-1在MSCs+CRMP-4RNAi注射组均有显著上调;脊髓微环境相关因子BDNF、NT-3、FGF-2、FGF-10在MSCs+CRMP-4RNAi注射组显著上调，VEGF、TGF-β、IGF在MSCs+CRMP-4RNAi注射组及CRMP-4RNAi注射组均有显著上调。
　　结论：
　　1、双向电泳联合质谱分析方法发现脊柱裂脊髓组织有13种差异表达蛋白质，其中5种表达上调和8种表达下调。
　　2、CRMP-4基因和蛋白质表达在正常脊髓中随着胎龄增加逐渐增高，在胚胎17-21天达到高峰，存在动态表达规律。
　　3、CRMP-4在先天性脊柱裂脊髓组织中异常高表达，可能与神经突生长抑制和凋亡有关。
　　4、先天性脊柱裂胎鼠的脊髓缺损区域局部注射RNAi沉默CRMP-4联合MSCs移植可减少细胞凋亡，调节细胞骨架和突触再生，改善脊髓微环境。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：先天性脊柱裂脊髓组织差异表达蛋白质的筛选

1 前言

2 材料与方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第二部分：CRMP-4在先天性脊柱裂不同胚胎发育期脊髓组织中的表达规律

1 前言

2 材料与方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第三部分：宫内骨髓间充质干细胞移植联合RNAi沉默CRMP-4对先天性脊柱裂胚胎的修复治疗

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

研究创新性的自我评价

参考文献

综述 神经管畸形的研究现状

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历