核因子-κB炎症信号通路在全身炎症反应时肺泡巨噬细胞过度活化中的作用及Emodin调节作用的实验研究

摘要

目的：探讨核因子-κB炎症信号通路在全身炎症反应时肺泡巨噬细胞过度活化中的作用，观察NF-κBp65/p50的活性和核易位情况、蛋白激酶IKK的活性变化、炎性细胞因子的表达水平，并深入探究蛋白激酶IKKα&γ对上述炎症信号通路中多个环节的协同调节效应及Emodin治疗作用的分子生物学机制；同时，进一步揭示一氧化氮(NO)在急性重症胰腺炎急性肺损伤大鼠发病中的双重功能及该作用与肺泡巨噬细胞NF-κB活性变化的密切联系，为临床治疗急性肺损伤等多种全身炎症反应性疾病、寻求更为合适的药物作用靶点提供新的实验佐证。 方法：实验一：以小鼠RAW264.7巨噬细胞系为研究对象，应用逆转录PCR、蛋白杂交印迹、免疫细胞化学染色、免疫荧光染色等方法，观察emodin对由LPS诱导产生的炎症反应的调节作用。共分为7组，每组5个培养皿：Group1：RAW264.7巨噬细胞正常培养组；Group2、3、4：给予LPS(10μg/ml)刺激，分三个时间点30min、2hr、5hr；Group5、6：分为三个时间点，在给予LPS(10μg/ml)刺激的基础上，同时加入emodin(20μg/ml)进行干预，于不同作用时间点收集的样本。 实验二：由NF-κB介导的过度炎症反应在许多炎性疾病的发生发展过程中发挥着举足轻重的作用，是全身炎症反应时复杂病理变化的中心环节，同时也是多种因素、多层面、多环节协同作用的结果。为进一步阐明上述协同作用的分子生物学机制，应用RNA干扰技术将IκB蛋白激酶α及γ基因沉默，然后观察RAW264.7小鼠巨噬细胞经LPS刺激后，NF-κB的活化以及多种NF-κB依赖性的下游炎性因子的表达情况。 实验三：经胰管逆行注入去氧胆酸钠复制大鼠急性重症胰腺炎急性肺损伤模型。采用凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测肺泡巨噬细胞中NF-kB活性和EMSA特异性，同时应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺泡巨噬细胞中的iNOSmRNA的表达，及NO、INFα、iNOS的水平和肺组织病理学的改变。随机分为：假手术组、模型组、硝普钠组、左旋精氨酸组、氨基胍组，每组6只。分离纯化的肺泡巨噬细胞以5x105的细胞浓度，接种于24孔培养板。加入LPS和各种药物，分为对照组、刺激组(LPS10μg/ml)、硝普钠组(LPS+硝普钠，2mmol/L)、左旋精氨酸组(LPS+左旋精氨酸，2mmol/L)、氨基胍组(LPS+氨基胍，2mmol/L)，于作用后3小时、5小时、6小时和24小时分别检测NF-kB活性、iNOSmRNA含量、TNFα浓度和NO含量。 结论：Emodin能够下调由LPS刺激活化的RAW264.7巨噬细胞中多种炎症细胞因子的表达释放，并通过改变转录因子NF-kB的活性及核易位、调节IkB-α的生成、IKKα和IKKγ的表达、干预前体蛋白p105(IkBγ)的产生及胞内分布等多个途径发挥其减轻炎症过度反应及防止发生系统性免疫缺陷等病理损害的作用。因此，本研究将为临床应用掌叶大黄治疗内毒素相关的炎性疾病提供强有力的实验理论依据。 蛋白激酶IKK-α及IKK-γ对NF-κB信号通路活化和相关炎症细胞因子表达调节的分子机制，不仅各自具有不同的功能特性及作用靶点，同时还存在彼此间的协同作用，并能通过此种方式，相互代偿以弥补单一蛋白功能活性受抑制时所产生的后续影响。本研究不仅丰富了蛋白激酶IKK家族在NF-κB炎症传导信号和炎症因子表达方面的调节机制及作用形式，而且为临床治疗多种炎性疾病，寻找更为适合的药物作用靶点提供了新的实验佐证。 外源性NO可抑制NF-kB活化，降低iNOSmRNA的表达，进而减少NO、TNFα的释放。同样，经iNOS选择性抑制剂抑制内源性NO的产生，也可控制机体的过度炎症反应。目前关于NO的正反两方面的认识，其原因是由于内源性与外源性NO作用的不同而引起的。而内、外源性NO在机体内的信号识别系统和信号传导途径也各不相同，就决定了二者功能上的差异。那么如何能有效的抑制内源性NO产生的机体损害和合理的应用外源性NO对调节肺血管张力等的有益作用将会成为今后临床研究的重点和关键环节。

目录

摘要

论文一 Emodin对NF-kB信号通路及炎症因子表达调控作用的实验研究

论文二NF-kB信号通路过度活化时IkB蛋白激酶α及γ发挥协同调节作用的实验研究

论文三一氧化氮对核因子-kB活化调节在急性胰腺炎诱发急性肺损伤中的作用

综述一NF-kB：全身炎症反应中的核心环节

综述二RNA干扰技术的实验进展及其医疗应用前景

致谢

缩略语表

作者简介