UCP2在大鼠再生肝抗四氯化碳损伤机制中的作用研究

摘要

目的：肝再生是肝脏对于切除或毒性损害的一种协调反应。再生肝有很强的抗损伤能力。对于这种抗损伤机制的研究不仅可以深入认识肝脏生理活动规律，揭示肝再生的调控机制，也必将为肝细胞保护的研究开阔新的领域。 肝细胞在68﹪肝切后数分钟进入细胞增殖周期，不同时间点的再生肝对于四氯化碳等肝毒剂都有一定的抗损伤表现，其中96h再生肝抗损伤能力最强。不同肝毒剂对肝细胞的损伤机制不尽相同，但它们都可以引起肝细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)的产生增加。大量ROS介导细胞氧化损伤，参与许多肝毒剂的肝损害过程，因此肝细胞内自由基的产生和清除成为肝脏抗损伤的关键问题。 解偶联蛋白2(uncouplingprotein2，UCP2)是晚近发现的线粒体内膜解偶联蛋白家族成员，广泛分布于人类及啮齿类动物的多种器官。目前，UCP2的生理功能尚不十分清楚，但有实验表明UCP2可以降低ROS产生，在细胞受到氧化损伤时起保护作用。因此我们推测UCP2可能通过其降低ROS的功能参与再生肝抗损伤过程。另外，UCP2引发质子漏，降低线粒体内质子跨膜梯度，使氧化磷酸化解偶联。如此以来UCP2的表达可能降低细胞内的能量储备，使细胞更易受到毒物损伤。因此再生肝内ATP合成会不会受到UCP2表达的影响也是本实验所要观察的内容。本研究还通过实验阐明了UCP2在ATP和ROS之间的调节功能及其对细胞的影响。 方法：本研究选用四氯化碳(carbontetrachloride，CCl4)做肝毒剂。健康雄性SD大鼠，随机分为4组(n=6)：假手术组(SO)，肝切组(PH)，假手术损伤组(SO/CCl4)和肝切损伤组(PH/CCl4)。乙醚麻醉下进行手术，肝切手术按文献方法切除2/3肝组织。假手术只打开腹腔，然后缝合，不实施肝切。手术后96h，假手术损伤组和肝切损伤组按5ml/kg体重50﹪CCl4(CCl4:豆油=1:1)灌胃，假手术组和肝切组按同样剂量和方式只给豆油。给药24h后腹主动脉取血留待检测血清谷丙转氨酶(alanineamiotransferase，ALT)水平，处死动物，取肝组织制匀浆检测谷胱甘肽(glutathione，GSH)、一氧化氮(nitrogenoxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，ATP)的含量。另取肝组织制备线粒体，检测过氧化氢(hydrogenperoxide，H2O2)和MDA含量。制作肝组织石蜡切片，HE染色观察肝形态学改变，免疫组织化学染色观察肝组织中UCP2蛋白表达。Westernblot方法检测肝线粒体内UCP2蛋白的表达并进行定量分析。 结果： 1.再生肝CCl4损伤后肝组织形态和血中ALT水平的改变 HE染色结果显示，假手术组肝细胞形态正常，中央静脉周围肝细胞索排列紧密；肝切组肝细胞轻度肿胀，有少量核分裂相，肝索结构清楚；假手术损伤组大鼠肝细胞索状排列紊乱，炎性和坏死细胞增多，出现气球样变和脂肪样变。肝切损伤组多数肝细胞形态正常，增生良好，仅局部区域有炎细胞浸润，未见肝细胞坏死。CCl4损伤后肝细胞内ALT释放入血，血清ALT水平：假手术损伤组约是假手术组的24倍(P＜0.001)，肝切损伤组约是肝切组的11倍(P＜0.001)。再生肝CCl4损伤后，其血清ALT水平明显低于假手术肝损伤(P＜0.001)。 2.再生肝CCl4染毒后组织GSH，NO和MDA含量的改变 再生肝GSH，NO和MDA的含量与假手术肝相比没有明显改变。CCl4染毒后，假手术肝组织内MDA含量明显增加(P＜0.001)；再生肝自身可以抑制CCl4引起的MDA上升，其MDA含量明显低于假手术染毒肝(P＜0.05)。CCl4毒性作用可以消耗肝组织中的NO和GSH，染毒24h后，假手术肝NO，GSH含量分别下降了54﹪(P＜0.001)和53﹪(P＜0.001)，再生肝内NO含量下降25﹪(P＜0.01)，而GSH含量未见明显降低。再生肝CCl4损伤后NO和GSH含量均明显高于假手术肝损伤(P＜0.001，P＜0.001)。 3.再生肝CCl4染毒后线粒体内H2O2和MDA含量的改变 肝切96h后线粒体内H2O2和MDA含量均增加(P＜0.05)。CCl4染毒使假手术肝线粒体内H2O2和MDA含量明显上升(P＜0.001)，而再生肝线粒体内H2O2与MDA在染毒后与不染毒两组之间没有明显差别。再生肝损伤后线粒体H2O2与MDA明显低于假手术肝损伤(P＜0.05，P＜0.01)。 4.再生肝CCl4染毒后UCP2表达的改变 免疫组化结果显示，假手术组肝实质细胞内没有UCP2表达。肝切组肝实质细胞胞浆内出现阳性染色颗粒。CCl4可以诱导UCP2在肝内的表达，假手术损伤组与肝切损伤组的肝实质细胞内阳性染色颗粒丰富，肝切损伤组UCP2表达最为丰富。Westernblot实验进一步证实免疫组化的结果，定量分析表明，肝切96h后UCP2表达增加(P＜0.05)；假手术损伤组的平均相对光密度与假手术组相比有显著性差异(P＜0.001)；肝切损伤组的平均相对光密度比肝切组高(P＜0.05)，与假手术损伤组相比有极显著性差异(P＜0.001)。 5.再生肝CCl4染毒后线粒体膜电位的改变 肝切96h后线粒体膜电位水平升高(P＜0.05)。CCl4染毒后，假手术肝线粒体膜电位水平降低(P＜0.05)，再生肝线粒体膜电位水平无明显改变。再生肝CCl4损伤后膜电位明显高于假手术肝损伤后的水平(P＜0.01)。 6.再生肝CCl4染毒后肝组织内ATP水平的改变 肝切96h后肝组织内ATP水平显著增高(P＜0.001)。CCl4染毒后，假手术肝组织内ATP水平显著下降，再生肝ATP水平明显高于假手术肝(P＜0.001)。 结论：1.UCP2可通过限制ROS产生，提高大鼠再生肝抗CCl4损伤能力。2.再生肝内UCP2高表达不会降低再生肝内ATP的水平。

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讨论

结论

参考文献

综述 解偶联蛋白2生理功能探讨——可能的细胞保护作用

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