microRNA-501-5p通过下调BLID促进胃癌细胞阿霉素耐药性和致瘤性

摘要

胃癌是消化系统常见恶性肿瘤，在世界范围内其致死率占恶性肿瘤第二位。除了根治性手术以外，化疗是治疗局部进展期和伴转移胃癌的有效手段。阿霉素是蒽环类细胞毒抗生素，是一种广谱抗肿瘤药物，可抑制肿瘤细胞DNA和RNA合成，临床上广泛用于治疗包括胃癌、乳腺癌、骨肉瘤、白血病等在内的多种实体和液体肿瘤，但临床实践证明该药易产生耐药性而影响其在临床上的应用。凋亡逃逸是肿瘤细胞对阿霉素耐受的主要原因之一。
　　microRNAs(miRNAs)是一类由内源基因编码的长度为19-25个核苷酸的单链非编码小RNA分子。近年来的研究表明，miRNAs可作为癌基因或抑癌基因在肿瘤细胞增殖、侵袭和转移以及化疗耐药中发挥重要作用。编码人microRNA-501-5p(miR-501)的基因位于X染色体。最近有研究报道miR-501在肝癌、肺腺癌和胃癌中异常高表达，miR-501表达增高与进展期肺腺癌密切相关，并且是胃癌预后不良的预测因子。但目前尚未有直接证据显示miR-501与阿霉素耐药有关。
　　BLID(BH3-1ike motif containing protein,cell death inducer)，又称BRCC2,是Bcl-2家族成员，于2004年在乳腺癌中首先被报道，可作为乳腺癌预后和远处转移的独立预测因子。BLID可通过与Bcl-XL结合，激活Caspase-9和Caspase-3引起线粒体途径的细胞凋亡，也可通过抑制Akt磷酸化，降低MMP-2和MMP-9分泌而抑制细胞增殖、侵袭和转移能力，被视为一种新的肿瘤抑制因子。miRNA分析软件Targetscan预测BLID可能是miR-501的靶点之一。因此，miR-501可能通过靶向负调控BLID促进胃癌细胞阿霉素耐药性和致瘤性。
　　目的:(1)验证miR-501与BLID的靶向关系。(2)探讨miR-501/BLID轴在胃癌阿霉素耐药和肿瘤发生发展中的作用及机制。
　　方法:(1)以胃癌阿霉素耐药细胞SGC7901/ADR和其母本细胞SGC7901以及胃癌BGC823细胞为实验对象。miR-501上调实验利用lipofectamine2000转染miRNA无关序列(NC组)、miR-501mimic（miR-501组）和针对BLID的小干扰RNA（siBLID组）。miR-501下调实验利用lipofectamine2000转染miRNA inhibitor无关序列(NCi组)、miR-501inhibitor（501i组）和siBLD与miR-501inhibitor共转染（501i+siBLID组）。Taqman探针法荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测miR-501表达水平，SYBR Green染料法荧光定量qRT-PCR检测BLID mRNA水平，Western blot检测BLID蛋白及其下游Caspase-3/-9、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达水平。
　　(2)化学合成包含miR-501结合位点的野生型BLID mRNA3'UTR双链（BLID-3'UTR）和miR-501结合位点突变的突变型BLID mRNA3'UTR双链(BLID-3'UTR-mut)，插入GV272载体XbaI酶切位点，通过荧光素酶报告基因实验验证BLID为miR-501直接靶点。通过细胞克隆形成实验检测miR-501对胃癌细胞增殖的影响。CCK-8实验检测阿霉素半数致死浓度(IC50)。流式细胞术检测miR-501对细胞凋亡的影响。Transwell小室实验检测miR-501对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。
　　(3)miR-501慢病毒表达载体（Len-501）、miRNA无关序列慢病毒表达载体(Len-NC)和BLID敲低慢病毒表达载体(shBLID)感染SGC7901细胞。15只裸鼠随机分为三组，分别在右腋皮下注射1×106个上述三组细胞。待裸鼠皮下肿瘤体积达到约100mm3时，经尾静脉注射阿霉素（5mg/kg），1周3次，持续2周后处死裸鼠，取出移植瘤组织。部分提取RNA，qRT-PCR检测miR-501和BLIDmRNA水平;部分提取蛋白质，Western blot检测BLID及其下游Caspase-9/-3、p-Akt蛋白表达水平。
　　结果:(1)SGC7901/ADR细胞IC50约为SGC7901细胞的10.65倍(P＜0.01)。SGC7901/ADR细胞内源性miR-501表达量显著高于SGC7901细胞(P＜0.05)，而SGC7901/ADR细胞中内源性BLID mRNA和蛋白表达水平则显著低于SGC7901细胞(P＜0.01)。
　　(2)胃癌SGC7901细胞和人肾上皮293T细胞共转染野生型BLID mRNA3'-UTR质粒和miR-501mimic组荧光素酶活性显著低于共转染野生型BLID mRNA3'-UTR质粒和miRNA无关序列组与共转染突变型BLID mRNA3'-UTR质粒和miR-501mimic组。荧光定量qRT-PCR结果显示，与NC组相比，在SGC7901和BGC823细胞中转染miR-501mimic（miR-501组）可显著降低BLID mRNA水平(P＜0.01)，而与阳性对照siBLID组相比则无显著差别(P＞0.05);Western blot结果显示miR-501组BLID蛋白表达水平也显著降低，而siBLID组与NC组相比则无显著差别。在SGC7901/ADR和BGC823细胞中转染miR-501inhibitor(501i组)后，与阴性对照NCi组和501i+siBLID组相比，BLID在mRNA和蛋白表达水平均明显提高(P＜0.01)。
　　(3)转染了miR-501mimic的SGC7901和BGC823细胞（miR-501组）阿霉素IC50显著高于NC组(P＜0.05)，与siBLID相比则无显著差别(P＞0.05)。SGC7901/ADR和BGC823细胞敲低miR-501（501i组）后阿霉素IC50显著低于NCi组和501i+siBLID组（P＜0.05）。
　　(4)SGC7901和BGC823细胞miR-501组和siBLID组的细胞凋亡率显著低于NC组(P＜0.01)，Western Blot结果显示miR-501组和siBLID组cleaved Caspase-9/-3表达水平低于NC组。SGC7901/ADR和BGC823细胞中miR-501敲低则细胞凋亡率高于NCi组和501i+siBLID组(P＜0.01)，cleaved Caspase-9/-3表达水平则升高。
　　(5)SGC7901和BGC823细胞miR-501组和siBLID组细胞克隆数显著高于NC组(P＜0.01)。Transwell小室迁移（无基质胶包被）和侵袭（基质胶包被）实验结果显示，SGC7901和BGC823细胞miR-501组和siBLID组细胞穿膜细胞数显著高于NC组(P＜0.01)，Western blot结果显示p-Akt表达水平也高于NC组。SGC7901/ADR和BGC823细胞敲低miR-501组细胞克隆数、穿膜细胞数显著低于NCi组和501i+siBLID组(P＜0.01)，p-Akt表达水平也低于两对照组。
　　(6)Len-501组、shBLID组裸鼠皮下成瘤的速度明显快于Len-NC组，在给予相同剂量和次数阿霉素后Len-501组、shBLID组皮下瘤体积明显大于对照组(P＜0.05)，Len-501组miR-501水平显著高于Len-NC组，Len-501组、shBLID组BLID mRNA水平和BLID蛋白表达水平明显低于Len-NC组，下游因子cleaved Caspase-9/-3蛋白表达水平降低，p-Akt表达水平则增高。
　　结论:(1)在胃癌细胞中BLID是miR-501的直接靶点，miR-501是在转录后水平负调控BLID表达。
　　(2)miR-501可促进胃癌细胞在体内外增殖、迁移和侵袭能力以及阿霉素耐药性。
　　(3)miR-501可能通过直接靶向下调BLID表达，进而一方面使Caspase-9/-3失活抑制细胞凋亡，另一方面使Akt磷酸化，促进胃癌细胞的阿霉素耐药性和致瘤性。miR-501可能成为阿霉素耐药和胃癌治疗的潜在候选靶点。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

1．材料

2 实验方法

3 统计学分析

结果

1．与胃癌SGC7901细胞相比，阿霉素耐药SGC7901／ADR细胞中内源性miR-501表达增高，同时内源性BLID表达降低

2．BLID是miR-501的直接靶点

3．miR-501通过靶向调控BLID增强胃癌细胞对阿霉素耐药

4．miR-501／BLID轴通过Caspase通路的失活抑制凋亡，从而增强阿霉素耐药

5．miR-501通过下调BLID和下游Akt磷酸化促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭

6．体内实验验证miR-501导致胃癌细胞阿霉素耐药并增强细胞的增殖能力

讨论

结论

参考文献

综述 microRNA在胃癌多重耐药机制中的研究进展

硕士学习阶段论文发表情况

致谢