McSNP分型方法的建立及FOXO3A非编码区SNP对基因表达水平的影响

摘要

目的:
　　1.采用McSNP法对位于人FOXO3A非编码区SNP位点分型。
　　2.制作FOXO3A及GAPDH内参基因的质粒标准品，构建可长期、间断性地对大量临床来源样本进行FOXO3A基因表达的定量检测体系。
　　3.分析SNP型对FOXO3A基因表达水平的影响。
　　方法:
　　1.分离14位健康献血者的单个核细胞(PBMC)，从中提取基因组DNA及总RNA。
　　2.McSNP分型方法的建立。首先设计包含SNP位点的特异性PCR扩增引物，应用该引物进行PCR反应，然后用限制性内切酶切割PCR产物，最后应用熔解曲线方法分析酶切产物，确定SNP型。应用PCR-限制性核酸多态性分析(PCR-RFLP)及PCR产物测序法对分型结果进行验证。
　　3.FOXO3A基因表达定量体系的建立。采用TA克隆的方法构建pGMT-FOXO3A、pGMT-GAPDH重组质粒，获得定量标准品，使用该标准品制作定量标准曲线。设计用于FOXO3A基因表达定量的特异性扩增引物，对标准品进行多次重复定量检测，计算定量结果的精密度与偏倚，评价定量体系的可检测范围。
　　4.对10份来源于健康献血者的DNA及RNA样本进行rs4946936分型和FOXO3A基因表达定量。应用统计学软件SPSS做独立样本T检验，比较组间的基因表达水平差异。
　　结果:
　　1.14位献血者rs4946936的McSNP分型结果及5位献血者rs2802288的McSNP分型结果均与RFLP分型法所得结果一致，PCR产物测序也验证了上述分型结果的准确性。McSNP分型法中rs4946936为TT型样本的熔解曲线显示为Tm值为77.25℃的单峰，TC型显示为Tm值为77.25℃和71.75℃的双峰，CC型显示为Tm值为71.25℃单峰。
　　2.TA克隆蓝白斑筛选实验显示质粒连接、转化成功，对阳性克隆采用PCR法鉴定，显示质粒中含有目的片段。将质粒作为标准品梯度稀释制作定量标准曲线，扩增效率在0.9-1.1之间，相关系数＞98％，FOXO3A定量结果显示样本基因表达水平在1.56×106-1.56×103copies/μl（Ct值20～30）范围内精密度变异系数小于5％，偏倚小于7.5％。
　　3.10位献血者rs4946936McSNP分型结果显示6个样本为CC型，3个样本为TC型，1个样本为TT型。rs4946936T突变型组(TT和TC型)与CC型组相比，FOXO3A基因表达水平未见统计学差异，p＞0.05。
　　结论:
　　1.成功建立了基于熔解曲线分析的McSNP分型方法。
　　2.构建了可长期对间断来源样本的FOXO3A基因表达量进行比较的检测体系。
　　3.对10份献血者的基因表达水平分析，未见不同rs4946936型别个体间FOXO3A基因表达水平具有明显差异。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 基于熔解曲线分析的SNP分型方法(McSNP)的建立

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分 FOXO3A非编码区SNP对基因表达水平的影响

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

致谢