体外和体内磷酸肌酸可降低血糖水平，改善肝细胞内质网应激的糖尿病小鼠

摘要

目的:
　　肝细胞受损可增加糖尿病(Diabetes mellituspatients，DM)患者发病率和死亡率。已公认，高血糖是DM患者肝损害发病的主要原因，与DM相关的肝细胞损害是DM患者常见的并发症。
　　磷酸肌酸(Phosphocreatine，PCr)分子作为一种可迅速动员、回收ATP，对脑和骨骼肌的能量储备，可作为细胞能量储备形式，它具有多种活性。然而，PCr是否具有保护DM相关肝损伤的作用尚未见报道。本研究旨在评价PCr是否能保护DM并发的肝损伤，并探讨其在体内外作用机制。
　　方法:
　　体外研究:丙酮醛(methylglyoxal，MGO)，是葡萄糖的活性代谢产物，与高血糖可引起DM相关的肝细胞损伤，且与肝细胞损害进展关系密切。
　　HepG2细胞培养及细胞进行预处理MGO两小时，然后，分别用不同浓度的PCR处理细胞（5mM，10mM，20mM）。采用MTT法研究胞形态学、细胞毒性、细胞凋亡;流式细胞仪Annexin V-FITC、Calcien法分别检测细胞凋亡、增殖试验。通过Western blotting检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平变化;以及内质网应激蛋白CHOP、ATF4、IRS的表达量。
　　体内研究:
　　Wistar大鼠单次腹腔注射链脲佐菌素（80mg/kg），然后，不同治疗组，分别20mg/kg和50mg/kg腹腔注射PCr。
　　采用肝组织匀浆生化分析法测定肝脏代谢物，如丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(Glutathione，GSH)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)，用免疫印迹法检测肝组织凋亡蛋白和内质网应激蛋白表达。
　　结果:
　　体外细胞一般治疗实验表明，MGO处理HepG2细胞出现损伤和凋亡，而经不同浓度PCr处理细胞可增强细胞增殖，减少细胞凋亡，改善细胞愈合。
　　Western blot结果显示，在MGO组，凋亡蛋白如caspase3和Bax蛋白表达增加，抗凋亡蛋白Bcl2降低，而PCr处理细胞，时间和剂量依赖性逆转之。进一步探讨了PCr对肝细胞内质网应激的保护机制，发现氧化应激诱导的肝损伤时，内质网应激蛋白水平显著升高，而PCr治疗细胞则呈剂量和时间依赖性逆转之。
　　体内经PCr治疗的DM相关性肝损伤研究显示血糖降低，且PCr对STZ诱导的DM相关肝内皮细胞损伤有保护作用。
　　另外，通过应用糖尿病动物模型验证和检测PCr否可以改善体内肝组织损伤，我们的结果显示，动物肝组织的组织病理学染色所示，在损伤诱导后，PCr具有保护作用，并快速恢复。此外，对肝组织进行生物化学测定，既分光光度法测定GSH、MDA和SOD，结果表明PCr的抗氧化作用可能涉及其保护机制。
　　此外，与STZ诱导的糖尿病相关的肝损伤相比，PCr处理的动物中凋亡蛋白水平和ER应激水平降低。Bcl-2/Bax蛋白比降低，Caspase-3和9蛋白表达降低。
　　结论:
　　本研究结果表明，PCr治疗DM相关肝损伤模型具有体内和体外保护作用，并具有抗氧化、抗凋亡作用。内质网应激作用可能参与:PCr通过影响ER应激信号转导中的保护作用机制。这可能为DM相关肝损伤患者提供一种可能的治疗策略。

目录

声明

Table of Contents

ABSTRACT

摘要

Abbreviations list

1．INTRODUCTION

1．1 Study hypothesis and objectives

1．2 Biomarkers

2．1 Materials

2．2 METHODS

2．2．1 Cell culture and reagents

2．2．2 MTT cells toxicity

2．2．3 Cells Morphology Assay

2．2．4 Caleien AM Cells Proliferation Assay

2．2．5 Wound Healing Assay

2．2．6 Western Blotting Analysis

2．2．7 Animal model

2．2．8 Animal Experimental Design and Follow up

3．Statistical Analysis

4．RESULTS

4．1 The Effect of PCr on Cells Morphology and Structure

4．3 PCr enhances wound healing process

4．4 PCrameliorates Hepatic Endoplasmic Reticulum Stress markers

4．5 Effect of PCr on blood glucose level and body mass

4．6 Effect of PCr on liver biochemical biomarkers

4．7 Effect of PCr on liver tissues histology

5．DISCUSSION

CONCLUSIONS

6．Acknowledgements and Research fund

REFERENCES

Part Ⅱ Literature Review Diab etes mellitus (DM) and Liver Injury

APPENDIX

PUBLISHED RESEARCH

ACKNOWLEDGEMENT