SIGIRR对重症急性胰腺炎腹水刺激巨噬细胞内TLRs信号通路的影响

摘要

背景与目的：
　　 重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis SAP)患者腹水中含有的酶类、炎症细胞因子和内毒素,这些毒性物质在SAP的早期阶段即可引起全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome SIRS),多器官功能衰竭(multi-organ fuction failure MOF),甚至患者的死亡。单核/巨噬细胞内TLRs信号通路的激活可诱导促炎因子的产生,这在SIRS和MOF发病中起重要作用。SIGIRR是TLRs信号的负性调控因子,它可抑制LPS诱导的TLRs信号通路的激活及其所致的炎症反应。在SAP的发生发展过程中SIGIRR是否起作用,目前未见报道。为此,本文以SIGIRR低表达和高表达的巨噬细胞为研究载体,研究胰源性腹水对巨噬细胞内TLRs信号通路的影响及SIGIRR对其的调控。为以SIGIRR为靶点防治SAP提供实验依据。
　　 研究方法:
　　 (1)SAP患者腹水对巨噬细胞内TLRs信号通路和SIGIRR的影响:
　　 用不同浓度的SAP患者腹水刺激小鼠巨噬细胞Raw264.7,实验分组如下:①对照组:巨噬细胞+1640培养基；②实验组1:巨噬细胞+含1.25％SAP患者腹水的1640培养基；⑨实验组2:巨噬细胞+含2.5％SAP患者腹水的1640培养基；④实验组3:巨噬细胞+含5％SAP患者腹水的1640培养基；⑤实验组4:巨噬细胞+含10％SAP患者腹水的1640培养基；分别在刺激后6h、12h、24h收集细胞。
　　 (2)基因转染:
　　 以未转染SIGIRR基因的巨噬细胞株Raw264.7为SIGIRR低表达株,采用脂质体转染技术将pUNO-mSIGIRR转入巨噬细胞,构建SIGIRR高表达细胞株。
　　 (3)SIGIRR对SAP患者腹水刺激的巨噬细胞内TLRs信号通路的影响:
　　 选择SAP患者腹水刺激的最佳浓度和最佳时间点(5％浓度,作用24h),实验分组如下:①对照组1:巨噬细胞+1640培养基；②对照组2:转染了空白对照质粒的巨噬细胞+1640培养基:③对照组3:转染了SIGIRR的巨噬细胞+1640培养基；④实验组1:巨噬细胞+含SAP患者腹水的1640培养基；⑤实验组2:转染了空白对照质粒的巨噬细胞+含SAP患者腹水的1640培养基；⑥实验组3:转染了SIGIRR的巨噬细胞+含SAP患者腹水的1640培养基；作用24h后分别收集细胞和细胞培养上清。
　　 (4)检测方法:
　　 ①用RT-PCR方法检测各组细胞内SIGIRR、TLR2、TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF-6 mRNA的表达；②用双抗体夹心ELISA方法检测细胞培养上清中IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-γ的含量。
　　 研究结果:
　　 (1)SAP患者腹水对巨噬细胞内TLRs信号通路和SIGIRR mRNA表达的影响:
　　 ①SAP患者腹水对巨噬细胞内SIGIRR mRNA表达的影响:在12h和24h时,各组巨噬细胞内SIGIRR mRNA的表达随着SAP患者腹水浓度的增加而逐渐降低(P<0.05),而6h时各组比较无统计学差异(P>0.05)；SAP患者腹水作用不同时间对巨噬细胞内SIGIRR mRNA的表达无影响(P>0.05)。
　　 ②SAP患者腹水对巨噬细胞内TLR4 mRNA表达的影响:在12h和24h时,各组巨噬细胞内TLR4 mRNA的表达随着SAP患者腹水浓度的增加而逐渐升高(P<0.05),而6h时各组间比较均无统计学差异(P>0.05)；在实验组2、3、4巨噬细胞内TLR4 mRNA的表达随着作用时间的延长而逐渐升高(P<0.05)。
　　 ③SAP患者腹水对巨噬细胞内MyD88、IRAK-1和TRAF-6 mRNA表达的影响:在24h时,巨噬细胞内MyD88、IRAK-1、TRAF-6 mRNA的表达随着SAP腹水浓度的增加而逐渐升高(P<0.05),而6h和12h时各组间比较均无统计学差异(P>0.05)；SAP患者腹水作用不同时间对巨噬细胞内MyD88、IRAK-1、TRAF-6mRNA的表达无影响(P>0.05)。
　　 ④SAP患者腹水对巨噬细胞内TLR2 mRNA表达的影响:在各时间点,各组巨噬细胞内TLR2 mRNA的表达各组间比较均无统计学差异(P>0.05)。
　　 (2)SIGIRR对SAP患者腹水刺激的巨噬细胞内TLRs信号通路的影响:
　　 ①SAP患者腹水对转染和未转染SIGIRR的巨噬细胞内SIGIRR mRNA表达的影响:未转染SIGIRR的巨噬细胞,经SAP患者腹水作用后其SIGIRR mRNA的表达均显著低于对照组(P<0.05),而转染TSIGIRR的巨噬细胞内SIGIRR mRNA的表达两组之间比较无显著差异(P>0.05)；无论是对照组还是在实验组中转染了SIGIRR的巨噬细胞内SIGIRR mRNA的表达均显著高于未转染和转染空质粒的巨噬细胞(P<0.05)。
　　 ②SAP患者腹水对转染和未转染SIGIRR的巨噬细胞内TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF-6 mRNA表达的影响:未转染SIGIRR的巨噬细胞,经SAP患者腹水作用后其TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF-6 mRNA的表达均高于对照组(P<0.05),而转染SIGIRR的巨噬细胞内TLR4、MyD88、IRAK-1、TRAF-6mRNA的表达两组之间比较无显著差异(P>0.05)；实验组转染了SIGIRR的巨噬细胞内TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF-6 mRNA的表达低于未转染和转染空质粒的巨噬细胞(P<0.05,P<0.001),但对照组转染SIGIRR对TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF-6 mRNA的表达无影响(P>0.05)。
　　 ③SAP患者腹水对转染和未转染SIGIRR的巨噬细胞内TLR2 mRNA表达的影响:SAP患者腹水对转染和未转染SIGIRR的巨噬细胞内TLR2 mRNA的表达均无影响(P>0.05)；同时SIGIRR对巨噬细胞内TLR2 mRNA的表达也无影响(P>0.05)。
　　 (3)SIGIRR对SAP患者腹水刺激的巨噬细胞培养上清中IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-γ含量的影响:
　　 ①SAP患者腹水对转染和未转染SIGIRR的巨噬细胞培养上清中IL-4含量的影响:SAP患者腹水对转染和未转染SIGIRR的巨噬细胞培养上清中IL-4含量均无影响(P>0.05)；同时SIGIRR对巨噬细胞培养上清中IL-4含量也无影响(P>0.05)。
　　 ②SAP患者腹水对转染和未转染SIGIRR的巨噬细胞培养上清中IL-10含量的影响:未转染SIGIRR的巨噬细胞,经SAP患者腹水作用后其细胞培养上清中IL-10含量均显著低于对照组(P<0.05),而转染SIGIRR的巨噬细胞其培养上清中IL-10含量两组之间比较无显著差异(P>0.05)；实验组转染了SIGIRR的巨噬细胞其培养上清中IL-10含量显著高于未转染和转染空质粒的巨噬细胞(P<0.05),但对照组SIGIRR对巨噬细胞培养上清中IL-10含量无影响(P>0.05)。
　　 ③SAP患者腹水对转染和未转染SIGIRR的巨噬细胞培养上清中IL-2、IL-17和IFN-γ含量的影响:未转染SIGIRR的巨噬细胞,经SAP患者腹水作用后细胞培养上清中IL-2、IL-17和IFN-γ含量均显著高于对照组(P<0.05,P<0.001),而转染SIGIRR的巨噬细胞其细胞培养上清中IL-2、IL-17和IFN-γ含量两组之间比较无显著差异(P>0.05)；无论是对照组还是实验组转染了SIGIRR的巨噬细胞其细胞培养上清中IL-2、IL-17和IFN-γ含量均显著低于未转染和转染空质粒的巨噬细胞(P<0.05)。
　　 ④SAP患者腹水对转染和未转染SIGIRR的巨噬细胞培养上清中IL-12含量的影响:无论是转染还是未转染SIGIRR的巨噬细胞,经SAP患者腹水作用后其细胞培养上清中IL-12含量均显著高于对照组(P<0.05)；无论对照组还是实验组转染了SIGIRR的巨噬细胞其培养上清中IL-12含量显著低于未转染和转染空质粒的巨噬细胞(P<0.05,P<0.001)。
　　 结论：
　　 (1)SAP患者腹水可显著抑制巨噬细胞内SIGIRR的表达,上调TLR4和其下游分子MyD88、IRAK-1和TRAF-6的表达,促进促炎细胞因子分泌,这可能是SAP引起SIRS和MOF重要机制之一。
　　 (2)给予外源性SIGIRR基因可阻断SAP患者腹水对TLRs信号通路的激活,下调MyD88、IRAK-1和TRAF-6的表达,这可能是其对TLRs信号通路的负性调控机制之一。
　　 (3)给予外源性SIGIRR基因可显著抑制SAP患者腹水作用的巨噬细胞促炎细胞因子分泌,促进抑炎细胞因子分泌,因此,SIGIRR有望作为SAP乃至其它炎症性疾病的治疗靶点。