单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体、多克隆抗体及单域重链抗体的制备

摘要

单核细胞增生性李斯特菌(简称单增李斯特菌,Listeria monocytogenes, LM)是一种常见的食源性致病菌,属于李斯特属(Listeria),是该属中唯一能引起人患病的病原菌。该菌对环境的适应性极强,可在低温、强酸、高盐等极端条件下生存和繁殖。同时,LM还能够穿越机体的多重屏障,引起严重的感染性疾病,如脑膜炎、败血症及流产等,感染后致死率高达20％-30%。近年来,欧美地区不断爆发 LM的感染事件,造成了巨大的财产损失和人员伤亡。鉴于LM的高危害性,在食品安全检测的相关项目中 LM被列为必检项目。因此,建立准确、高效且适用于食品行业的快速检测方法,具有迫切的现实需求和广阔的应用前景。
　　本文首先以热灭活的 LM菌体为抗原免疫 BALB/c小鼠,成功筛选获得了6株能稳定分泌抗-LM单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3F2-A8、8C8-B11、10A11-A4、10E7-H6、11B9-F4、12A6-H11。6株单抗的效价分别为1:320000、1:640000、1:640000、1:640000、1:640000、1:25600。Dot-blot结果表明,6株单抗与李斯特属内菌及部分属外菌存在不同程度的交叉反应。Western-blot结果表明,3F2-A8、8C8-B11、10A11-A4、10E7-H6、11B9-F4的对应抗原为磷壁酸类物质。
　　针对采用菌体免疫制备抗体特异性较差的现状,本文通过构建表达载体pGEX-actA、pET-22b-InlB、pET-22b-iap进行原核表达,并以纯化的 InlB和 P60为抗原免疫 BALB/c小鼠以制备高特异性的抗体。Dot-blot结果表明,抗-InlB多抗能特异性识别 LM,与李斯特6种属内菌无交叉反应;抗-P60多抗与 LM ATCC13932、CMCC54001及其余50株 LM食品分离株均有反应,同时也与李斯特属内菌-绵羊李斯特菌 NCTC11288、英诺克李斯特菌 ATCC19119、威尔李斯特菌 ATCC35897存在交叉反应。上述结果表明,原核表达的 InlB和 P60可用于制备特异性强及亲和力高的李斯特菌单抗。
　　此外,本文进一步以驼源天然噬菌体展示抗体库淘选了针对 LM的特异性单域重链抗体。以热灭活的 LM菌体为抗原,通过4轮常规淘选和1轮消减淘选。采用 phage-ELISA法,对后4轮淘选洗脱物中随机挑选的384个噬菌体克隆进行了鉴定,其中阳性克隆112个。经序列比对、分类及统计,从中挑取10个亲和力较高的克隆进行特异性分析。结果显示淘选获得了2株能特异性识别LM的单域重链抗体,编号为 L5-78和 L5-79。构建了 pET-25b-L5-78和pET-25b-L5-79的表达载体,经大肠杆菌 BL21表达纯化获得单域重链抗体。性能分析结果显示2株抗体均可在极端 pH、高变性剂及高温下保持较高的活性,具有良好的稳定性。以4A7单抗及 L5-79单域重链抗体建立了双抗夹心 ELISA法,LM检测限为5×106 CFU/mL。
　　总之,本研究通过3种方法制备针对 LM的抗体,成功获得了6株单抗、2种多抗血清及2株单域重链抗体。以上研究工作为建立快速检测 LM的免疫学方法奠定了基础。

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第一章 引言

1.1 概述

1.2 单增李斯特菌简介

1.3 抗体技术简介

1.4 展望

第二章 抗单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体的制备

2.1 材料与仪器

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 抗单核细胞增生性李斯特菌多克隆抗体的制备

3.1 材料与仪器

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 抗单核细胞增生性李斯特菌单域重链抗体的制备

4.1 材料与仪器

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.5 讨论

4.6 小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

附录 A 实验菌株

附录 B 实验仪器设备

附录 C 实验试剂药品

附录 D 常用试剂的配制

附录 E pGEX-4T-1-actA 基因测序

附录 F pET22b-inlB 基因序列

附录 G pET22b-iap 基因序列

附录 H pET25b-L5-78 基因序列

附录 I pET25b-L5-79 基因序列

附录 J 部分单域重链抗体氨基酸序列

个人介绍

攻读学位期间的研究成果