姜黄素对高糖诱导的H9C2心肌细胞炎症的保护作用及机制研究

摘要

目的：
　　1、观察高糖对H9C2心肌细胞生物活性的影响。
　　2、观察姜黄素对高糖诱导的H9C2心肌细胞的生物活性、炎症反应的影响。
　　3、探讨姜黄素抑制高糖诱导的H9C2心肌细胞炎症反应的机制。
　　方法：
　　1、体外正常糖培养H9C2心肌细胞，再分别用高糖、姜黄素、肝X激动剂/抑制剂、TLR抑制剂、PP2A抑制剂进行干预。
　　2、实验分组：①Control组：正常对照组，用正常糖培养基（5.5mmol/L）培养H9C2细胞；②HG组：阳性对照组，用高糖培养基（33mmol/L）培养H9C2细胞；③HG+T0901317组：对HG组用肝X激动剂（T0901317终浓度20μmol/L）进行干预；④HG+TAK-242组：对HG组用TLR抑制剂（TAK-242终浓度100nmol/L）进行干预；⑤HG+Curcumin组：对HG组用姜黄素（Curcumin终浓度10μmol/L）进行干预；⑥HG+5CPPSS-50组：对HG组用肝X抑制剂（5CPPSS-50终浓度15μmol/L）进行干预；⑦HG+5CPPSS-50+Curcumin组：在HG+5CPPSS-50组的基础上加用Curcumin进行干预；⑧HG+Okadaic acid组：对HG组用PP2A抑制剂（Okadaic acid终浓度20nmol/L）进行干预；⑨HG+Okadaic acid+Curcumin组：在HG+Okadaic acid组的基础上加用Curcumin进行干预。
　　3、相应组中加入相应药物干预72h后，用CCK-8检测各组H9C2心肌细胞的生长状况；ELISA试剂盒测各组炎症因子（IL6、TNFα、MCP1）分泌量；同时应用qRT-PCR检测各组LXRα、IRAK4、PP2AcmRNA水平；Western blot检测各组NF-κB p65(总量和核内)、LXRα、IRAK4、p-PP2Ac蛋白的表达并比较。
　　结果：
　　1、CCK-8检测各组H9C2心肌细胞的生长状况结果显示：高糖可使细胞增殖活力下降，LXRs激动剂、TLR抑制剂、姜黄素可以减轻高糖对H9C2心肌细胞增殖活力的抑制，而LXRs抑制剂或PP2A抑制剂干预后细胞增殖活力抑制加剧。在LXRs抑制剂或PP2A抑制剂干预的基础上使用姜黄素不能改善高糖对H9C2心肌细胞增殖活力的抑制。
　　2、ELISA法检测各组细胞上清中炎症因子（IL6、TNFα、MCP1）的分泌量，结果表明：高糖作用下细胞培养上清中炎症因子含量明显增高（P<0.05）。T0901317、TAK-242、Curcumin干预后炎症因子分泌量减少（P<0.05）。5CPPSS-50或Okadaic acid加剧炎症因子释放（P<0.05）。相对HG+Curcumin组，在LXRs抑制剂或PP2A抑制剂干预的基础上使用Curcumin不能降低炎症因子含量（P<0.05）。
　　3、qRT-PCR检测各组LXRα、IRAK4、PP2Ac mRNA水平：高糖可使LXRαmRNA水平轻微上升，但无统计学差异（P>0.05），而IRAK4和PP2Ac mRNA明显上调（P<0.01）。与 HG组相比：HG+T0901317组、HG+TAK-242组、HG+Curcumin组LXRα mRNA进一步上调（P<0.01），IRAK4 mRNA则明显下降（P<0.01）；HG+5CPPSS-50组结果提示LXRα mRNA明显受到抑制（P<0.01），IRAK4 mRNA进一步上调（P<0.01）。在LXRs抑制剂干预的基础上使用Curcumin不能发挥Curcumin上调LXRα mRNA水平的作用。另外与HG组相比还表明：PP2A抑制剂干预将进一步明显上调PP2Ac mRNA水平（P<0.01），Curcumin干预则可以明显下调PP2Ac mRNA水平（P<0.01），而在PP2A抑制剂干预的基础上使用Curcumin将明显减弱Curcumin下调PP2Ac mRNA水平的作用。
　　4、Western blot检测各组NF-κB p65(总蛋白和核内组分)、LXRα、IRAK4、p-PP2Ac蛋白的表达结果：各组NF-κB p65总蛋白表达无明显差异（P>0.05）。高糖可使LXRα蛋白表达水平轻微上升，但无统计学差异（P>0.05），而胞核内NF-κB p65、IRAK4和p-PP2Ac蛋白表达明显上调（P<0.01）。与HG组相比：HG+T0901317组、HG+TAK-242组、HG+Curcumin组LXRα蛋白表达则进一步上调（P<0.05），IRAK4蛋白和胞核内NF-κB p65蛋白表达则明显下降（P<0.05）；HG+5CPPSS-50组结果提示LXRα蛋白表达受到抑制（P<0.05），IRAK4蛋白和胞核内NF-κB p65蛋白表达进一步上调（P<0.01）。在LXRs抑制剂干预的基础上使用Curcumin不能发挥Curcumin上调LXRα蛋白表达、抑制NF-κB p65入核的作用。另外，与 HG组相比较还表明：PP2A抑制剂干预将进一步上调p-PP2Ac、胞核内NF-κB p65蛋白含量（P<0.05），Curcumin干预则可以明显下调p-PP2Ac蛋白表达（P<0.01），而在PP2A抑制剂干预的基础上使用Curcumin将明显减弱Curcumin下调p-PP2Ac表达、抑制NF-κB p65入核的作用。
　　结论：
　　1、高糖可诱导H9C2心肌细胞发生炎症反应，姜黄素可以抑制高糖诱导的H9C2心肌细胞炎症反应。
　　2、姜黄素能够上调LXRα表达，还可以抑制IRAK4、p-PP2Ac表达，活化PP2A负性调控TLR-NF-κB途径，减少NF-κB p65入核，进而抑制炎症因子（IL6、TNFα、MCP1）表达，并可能通过这种效应来减轻高糖诱导的H9C2心肌细胞炎症反应。从而提示LXRs、TLR-NF-κB信号通路及相关蛋白激酶和磷酸化酶之间的整合作用可能是姜黄素减轻高糖诱导的H9C2心肌细胞炎症反应的细胞分子机制。

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中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1实验材料

2.2 实验方法

2.3 统计学分析

第3章 结果

3.1 H9C2细胞的生长特点

3.2 CCK-8和细胞计数法摸索姜黄素最佳干预时间和浓度

3.3 CCK-8法检测各组H9C2心肌细胞增殖情况

3.4 ELISA法检测各组细胞上清中IL6、TNFα、MCP1的含量

3.5 不同干预条件对心肌细胞LXRα、TLR-NF-κB通路的影响

3.6 姜黄素改善心肌细胞炎症反应

第4章 讨论

4.1姜黄素对高糖诱导的心肌细胞增殖活力的影响

4.2姜黄素对高糖诱导的心肌细胞炎症因子的影响

4.3姜黄素对高糖活化NF-κB信号通路的影响

4.4姜黄素对高糖作用下心肌细胞LXRs的影响

4.5姜黄素对高糖诱导下心肌细胞内蛋白激酶和磷酸化酶的影响

4.6姜黄素的临床应用前景

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望与不足

致谢

参考文献

综述: 姜黄素在糖尿病心肌病中保护作用的研究进展