Celf1在模拟强直性肌营养不良RNA毒性致成肌分化缺陷中的部分调节作用

摘要

目的：研究Celf1对模拟强直性肌营养不良RNA毒性致成肌分化缺陷中的部分调节作用。
　　方法：
　　1、C2C12成肌细胞培养与分化，并进行成肌分化诱导。于0，1，2，4，6时间点进行样品收集。
　　2、质粒构建与转染，构建 GFP-CUG5和 GFP-CUG200质粒，构建后利用脂质体转染入C2C12细胞中；构建pMSCV-Celf1 Flag-puro质粒，将Baylor医学院Tom Cooper提供pcDNA3-Celf1Flag质粒中含有Celf1 Flag的EcoRI片段插入 pMSCV-puro质粒，将质粒用293T细胞包装制备逆转录病毒，随后转染C2C12细胞； Celf1 shRNA慢病毒载体和对照组Scrambled shRNA病毒由20μg shRNA编码的慢病毒载体和150μg包装载体 psPAX2以及10μg包膜载体pMD2.G共同转染入150mm培养皿的293T细胞中,收集上清转染C2C12细胞。
　　3、抗体与免疫测定，western blot测定,按常规方法将转膜蛋白转移至硝酸纤维素膜上。先后用Celf1单克隆鼠抗, Flag, Actin一抗孵育及辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG二抗进行孵育，增强荧光试剂显色。
　　4、实时定量RT?PCR及RT?PCR选择性剪切分析,以GAPDH作为标准对照，测定 MyoD(Myf3)、Myogenin(MyoG)、Mef2c、Celf1等基因在成肌分化中的变化。提取总RNA，使用特异性引物扩增Zasp、MBNL-1、Z-TTN、M-TTN、和BIN-1，PCR产物用1％琼脂凝胶分，DNA条带利用 ImageJ软件进行分析。
　　5、流式细胞术及荧光激活细胞分选（FACS）,测定成肌细胞增殖及早期分化的细胞周期分布，用胰蛋白酶将细胞消化后，洗涤、固定、染色，并使用Acuri C6流式细胞仪及Flowjo软件和Dean–Jett–Fox模型对结果及数据进行分析。
　　6、细胞染色量化与统计分析，核融合指数计算方法为肌管内总细胞核数（≥2 nuclei）占总细胞核数百分比。总肌管面积为图像被肌管覆盖区域所占百分比。每组分析至少涵盖1000个细胞核及至少3个随机选择区域，统计数据分析应用t检验评估两组差异性，P<0.05。
　　结果：
　　1、3?非翻译区的CUG扩增导致成肌细胞的细胞周期加速和分化损伤
　　（1）α肌凝蛋白重链染色（MF20）可见GFP-CUG5组细胞肌管形成明显，相反，GFP-CUG200肌管形成数量很少；
　　（2）三个独立量化实验结果表明GFP-CUG5组核融合指数达(38.9±8.7)%，而GFP-CUG200组融合指数仅(2.2±0.8)%。同样的，GFP-CUG5组肌管面积达(40.2±12.0)%，而GFP-CUG200组肌管面积仅(3.3±0.8)%；
　　（3）RT-PCR结果显示，CUG200在成肌细胞增殖和早期分化过程中Celf1 mRNA表达显著增加，CUG200抑制细胞增殖和分化过程中MyoD的表达，MyoG和Mef2C表达也被抑制，与分化缺失结果一致；
　　（4）Western blot结果显示CUG200组Celf1蛋白水平也相应地上升；
　　（5）FACS分析结果显示，在增殖未分化的成肌细胞中，CUG200的G1期细胞显著减少，细胞周期撤退增加。
　　2、过表达Celf1抑制成肌细胞细胞周期撤退及损伤成肌分化
　　（1）Western blot结果显示，Flag标签Celf1仅出现在pMSCV-Celf1 Flag转换细胞中，其Celf1蛋白表达水平上调；
　　（3）肌管融合指数Celf1Flag组(5.2±2.0)%而对照组为(34.9±11.7)%；肌管面积Celf1Flag组(5.4±3.0)%，对照组(29.8±12.7)%；
　　（4）通过对肌细胞分化过程中基因表达研究，我们发现 Celf1过表达会导致未分化的成肌细胞MyoD表达增加,与对照组组相比，即使MyoD在分化处理当日（day0）表达增加，在随后分化第1日（day1）至第6日（day6）MyoD表达明显降低，MyoG及Mef2C表达仍然被抑制，这与肌管形成缺失相符；
　　（5）FACS细胞周期分析显示，30.7%Celf1过表达成肌细胞停留在G1期未分化阶段，而对照组G1期细胞比例43.6%，说明Celf1过表达抑制成肌细胞分化过程中细胞周期撤退；
　　3、敲减Celf1促进早期成肌细胞分化
　　（1）western blot结果显示，与对照组比较，Celf1敲减组Celf1蛋白表达下降；
　　（2）免疫荧光染色结果显示，在分化过程中，肌管在 Celf1敲减细胞中形成增加；
　　（3）融合指数和肌管面积分别为(45.0±7.1)%和(38.6±7.2)%,对照组分别为(22.0±1.9)%和(16.1±2.6)%；
　　（4）通过实时定量PCR我们发现Celf1敲减细胞表达是一个循序渐进的过程。Celf1敲减细胞中MyoD，MyoG和Mef2C的表达显著增加，支持成肌细胞分化增加的结果;
　　（5）FACS细胞周期分析显示：增殖期对照组细胞16.0%停留在G1期，而Celf1敲减组为16.4%；
　　4、敲减Celf1部分挽救CUG扩增引起的成肌分化缺陷
　　（1） western blot结果显示，与对照组比较，Celf1敲减组Celf1蛋白表达下降；
　　（2）MF20染色结果显示，Celf1 shRNA的导入致CUG200组成肌分化增加。与对照组相比，表达Celf1 shRNA的成肌细胞多核肌管显著；
　　（3）核融合指数从(2.3±1.4)%增加至(17.6±1.1)%，相应地，肌管面积从(4.7±3.1)%增加至(12.7±2.4)%，但Celf1敲减的成肌细胞不能完全恢复至野生型细胞成肌分化程度；
　　（4）实时定量PCR分析MyoD，MyoG和Mef2C也支持Celf1 shRNA部分挽救CUG扩增导致的成肌分化缺陷；
　　（5）FASC细胞周期分析提示Celf1 shRNA纠正CUG200异常增加的细胞周期，流式细胞术及荧光激活细胞分选技术结果显示 Celf1 shRNA的 CUG200成肌细胞中停留在细胞周期G1期细胞比例为43.3%，显著大于对照组G1期31.5%细胞比例；
　　（6）选择性剪切分析显示，成肌细胞基因表达过程的选择性剪切未完全被Celf1 shRNA逆转。
　　结论：
　　1、Celf1在调节肌细胞周末分化中起着独立的负性调节作用，是导致RNA毒性作用的部分原因。
　　2、靶向 Celf1可能为纠正强直性肌营养不良表型，尤其是成为先天性病例的有效治疗策略。

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中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 细胞与化疗药物

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器37℃恒温培养箱

2.1.4 质粒

2.2 方法

2.2.1 细胞培养与分化

2.2.2 细胞传代

2.2.3 细胞冻存

2.2.4 细胞复苏

2.2.5 细胞计数

2.2.6 C2C12细胞转染/转导及筛选

2.2.7 RNA提取和实时定量PCR测定mRNA表达水平

2.2.8 细胞免疫荧光染色

2.2.9 Western Blot 测定蛋白表达

2.2.10 流式细胞术及荧光激活细胞分选（FACS）

2.2.11 细胞染色量化与统计分析

第3章 结果

3.1 3’非翻译区的CUG扩增导致成肌细胞的细胞周期加速和分化损伤。

3.2 过表达Celf1可抑制成肌细胞细胞周期撤退及损伤成肌分化

3.3 敲减Celf1促进早期成肌细胞分化

3.4 敲减Celf1部分挽救CUG扩增引起的成肌分化缺陷

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: 强直性肌营养不良1型病理机制研究进展