自噬在纳米氧化锌诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡中的作用及机制研究

摘要

目的：
　　纳米氧化锌（Zinc oxide nanoparticles，ZnO NPs）在工业中广泛应用，其除对肝脏和神经有毒性之外，还对雄性生殖系统有毒性，但其确切机制仍不甚清楚。本课题主要通过观察ZnO NPs对活体雄性小鼠睾丸组织和小鼠睾丸间质细胞的影响，探究自噬在ZnO NPs诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡中的作用及调节机制。
　　方法：
　　用HE染色检测ZnO NPs对小鼠睾丸及附睾的病理损伤，用Western blot检测ZnO NPs对小鼠睾丸组织的凋亡和自噬的影响，活性氧检测试剂盒检测ZnO NPs对小鼠睾丸组织和小鼠睾丸间质TM3细胞氧化应激的影响。用ELISA法检测ZnO NPs对小鼠血清睾酮含量的影响。用MTT法检测ZnO NPs和H2O2对小鼠睾丸间质TM3细胞活性的影响；分别用Western blot和Annexin V-FITC/PI双染色法检测ZnO NPs对TM3细胞凋亡的影响；分别用Western blot和电镜检测ZnO NPs和H2O2对TM3细胞自噬的影响。
　　结果：
　　用不同浓度的ZnO NPs（0,100,200,400 mg/kg/d）连续给小鼠灌胃28天后，与对照组相比，ZnO NPs对小鼠睾丸及附睾系数无明显影响（P＞0.05）。HE染色结果显示，对照组小鼠睾丸生精细胞排列整齐、紧致；与对照组相比，100 mg/kg ZnO NPs处理组的小鼠睾丸生精细胞排列也比较整齐，并无明显的生精细胞脱落；200及400 mg/kg ZnO NPs处理组的小鼠睾丸生精细胞排列明显紊乱、松散，并出现不同程度的脱落。ZnO NPs还显著降低小鼠附睾中的精子数量。Western blot结果显示， ZnO NPs可增加小鼠睾丸组织内 cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3、Bax蛋白含量并抑制Bcl-2蛋白的表达，提示ZnO NPs可诱导小鼠睾丸组织凋亡。ZnO NPs还可使小鼠睾丸组织内自噬标志蛋白LC3-II含量、LC3-II/LC3-I的比例以及自噬相关蛋白Atg-5和 Beclin-1的表达显著增加，提示ZnO NPs可诱导小鼠睾丸组织自噬。与对照组相比，ZnO NPs处理组小鼠睾丸组织中的MDA和GSH含量分别增加和降低；ZnO NPs还呈浓度依赖式地抑制小鼠睾丸组织内SOD和GSH-PX的活性，提示ZnO NPs可诱导小鼠睾丸组织产生氧化应激。ELISA结果显示， ZnO NPs可显著降低小鼠血清中睾酮含量（P＜0.05），提示ZnO NPs可能影响睾丸间质细胞的功能。
　　体外实验表明，ZnO NPs呈浓度依赖式地抑制小鼠睾丸间质TM3细胞活性（P＜0.05），并显著增加TM3细胞内cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3和Bax蛋白含量和抑制细胞内Bcl-2蛋白的表达，提示ZnO NPs可诱导TM3细胞凋亡。Annexin V-FITC和PI双染色法进一步证实ZnO NPs可诱导TM3细胞凋亡。ZnO NPs可诱导小鼠睾丸间质细胞产生氧化应激（P＜0.05）；H2O2在显著抑制TM3细胞活性的同时（P＜0.05），还可诱导TM3细胞凋亡，而在用N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine， NAC）抑制细胞氧化应激后，ZnO NPs对细胞活性的抑制和凋亡的诱导作用均明显减弱。以上结果显示，氧化应激参与了ZnO NPs对TM3细胞凋亡的诱导。Western blot结果显示，ZnO NPs和H2O2可诱导小鼠睾丸间质TM3细胞自噬，用NAC抑制细胞内氧化应激后，ZnO NPs对TM3细胞自噬的诱导明显降低，提示氧化应激还参与了ZnO NPs对小鼠睾丸间质TM3细胞自噬的诱导。在用自噬抑制剂3甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）抑制细胞自噬后，ZnO NPs对TM3细胞活性的抑制和细胞凋亡的诱导更明显。
　　结论：
　　氧化应激参与了ZnO NPs对小鼠睾丸组织和小鼠睾丸间质TM3细胞的凋亡和自噬；自噬抑制可显著增加ZnO NPs对TM3细胞的凋亡。

目录

声明

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

第3章 结果

3.1. ZnO NPs的特征

3.2. ZnO NPs对小鼠睾丸及附睾系数的影响

3.3. ZnO NPs对小鼠睾丸毒性的影响

3.4. ZnO NPs对小鼠精子数量的影响

3.5. ZnO NPs对小鼠睾丸组织凋亡和自噬的影响

3.6. ZnO NPs对小鼠睾丸组织氧化应激的影响

3.7. ZnO NPs对小鼠血清睾酮的影响

3.8. ZnO NPs对小鼠睾丸间质TM3细胞活性的影响

3.9. ZnO NPS对小鼠睾丸间质TM3细胞凋亡的影响

3.10. ZnO NPs对小鼠睾丸间质TM3细胞氧化应激的影响

3.11. 氧化应激对小鼠睾丸间质TM3细胞凋亡的影响

3.12. 氧化应激参与ZnO NPs对小鼠睾丸间质TM3细胞凋亡的诱导

3.13. Western blot检测ZnO NPs对小鼠睾丸间质TM3细胞自噬的影响

3.14. Western blot检测氧化应激对小鼠睾丸间质TM3细胞自噬的影响

3.15. Western blot检测氧化应激是否参与ZnO NPS对小鼠睾丸间质TM3细胞自噬的诱导

3.16. 透射电子显微镜检测ZnO NPs对小鼠睾丸间质TM3细胞自噬的影响

3.17. 自噬在ZnO NPs诱导小鼠睾丸间质TM3细胞凋亡中的作用

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:金属纳米材料对雄性生殖系统影响的研究进展