转基因水稻中表达胰岛素样生长因子IGF-I及其结合蛋白IGFBP-3的研究

摘要

胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factors，简称IGFs)是一类与人类胰岛素结构和功能相似的多功能细胞增殖调控因子。在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用。IGFs家族由两种多肽(IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、两类特异性受体及六种结合蛋白组成。IGF-Ⅰ是人体内肝细胞、肾细胞、脾细胞等十几种细胞自分泌和旁分泌的一种活性蛋白多肽物质。研究表明，IGF-Ⅰ具有降血糖、降血脂、舒张血管、促进骨的合成代谢保持其正常结构功能、促生长、促细胞分化、创伤修复的功能。在骨质疏松症、糖尿病、心血管疾病上具有预防和治疗的作用。IGFBP-3(Insulin-like growth factor binding protein 3)作为IGFBPs家族成员之一，可通过IGF-Ⅰ依赖及非IGF-Ⅰ依赖方式调节细胞增殖和凋亡。最近的研究发现IGFBP-3与肿瘤的发生发展密切相关，具有促凋亡、抑制细胞生长、增强癌细胞的放射敏感性等作用，IGFBP-3已成为抗肿瘤治疗的一个新靶点。因此本研究通过农杆菌介导，将IGF-Ⅰ基因和IGFBP-3基因导入水稻中，以期以水稻作为生物反应器大量生产该蛋白。
　　 本研究以人源IGF-Ⅰ基因和IGFBP-3基因序列为基础进行修饰，然后人工合成该基因。首先在其两端分别加上蛋白标签(FLAG)，FLAG蛋白标签是一个与重组蛋白相融合的由8个亲水氨基酸组成的多肽片断，具有与特异性单抗结合的位点，以便以后对其蛋白提纯。其次加上内质网滞留序列(KDEL)，可以避免其在植物细胞内的降解。最后加上过表达水稻种子贮藏蛋白基因Glu-2(Gt1)，使IGF-Ⅰ和IGFBP-3基因可以在水稻种子中特异表达。将改造好的基因连接到构建好的植物表达超双元载体上，利用冻融法转入农杆菌菌株EHA105中，侵染水稻种子，经潮霉素筛选，最终获得再生植株。再生植株经潮霉素、PCR检测，获得了的转基因植株。再对其转基因植株的幼穗提取RNA进行RT-PCR分析，证明大多数植株均转录所需的目的基因IGF-Ⅰ和IGFBP-3，Western blot结果表明其表达蛋白具有胰岛素样生长因子原性。癌细胞凋亡实验证明，水稻中表达的IGFBP-3具有生物活性，对乳腺癌细胞和肠癌细胞的生长具有明显的抑制作用。为进一步研究IGF-Ⅰ和IGFBP-3的生理机制奠定了基础。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 植物生物反应器研究进展

1．1．1 植物生物反应器的优势

1．1．2 植物生物反应器存在的问题及解决办法

1．2 转基因水稻的相关研究

1．2．1 转基因水稻的研究现状

1．2．2 转基因水稻的安全性

1．3 IGF-I和IGFBP-3的研究进展

1．3．1 概述

1．3．2 IGF-I的结构及生物学功能

1．3．3 IGFBP-3的结构特点及生物学功能

1．4 本研究的目的

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 供试水稻品种

2．1．2 超双元载体

2．2 质粒DNA的提取、纯化

2．3 培养基

2．4 根癌农杆菌的培养及其介导的水稻共转化

2．4．1 农杆菌的制备

2．4．2 水稻种子成熟胚愈伤组织的诱导

2．5 转基因水稻植株中潮霉素抗性的检测

2．6 PCR分析

2．6．1 水稻植株叶片总DNA的提取：

2．6．2 PCR扩增

2．7 RT-PCR分析

2．7．1 去除RNA分离物中的基因组DNA

2．7．2 RT-PCR

2．8 水稻成熟种子中总蛋白Western blot分析

2．8．1 总蛋白的提取

2．8．2 加样

2．8．3 电泳

2．8．4 电转移

2．8．5 抗原抗体反应

2．9 肿瘤细胞凋亡实验

2．9．1 细胞培养及技术

2．9．2 WST法检测

第三章 结果与分析

3．1 转基因水稻植株的获得

3．2 转基因水稻植株的PCR鉴定

3．2．1 A号材料的PCR鉴定

3．2．2 B号材料的PCR鉴定

3．3 转基因植株中目的基因的表达分析

3．3．1 RT-PCR分析

3．3．2 水稻成熟种子中总蛋白Western blot分析

3．4 水稻中表达的IGFBP-3蛋白对肿瘤细胞凋亡率的影响

3．4．1 不同转基因系中IGFBP-3蛋白对HT-29细胞凋亡率的影响

3．4．2 不同转基因系中IGFBP-3蛋白对MCF-7细胞凋亡率的影响

3．4．3 不同浓度IGFBP-3蛋白对HT-29细胞凋亡率的影响

第四章 小结与讨论

4．1 小结

4．2 讨论

参考文献

致谢

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