单宁酸对布氏田鼠下丘脑弓状核食欲调控基因表达和血清瘦素水平的影响

摘要

植物次生代谢物是植物对植食性动物进行化学防御的产物。具有苦涩味的单宁酸是一种重要的次生代谢物，影响植食性动物的取食行为。下丘脑弓状核神经元分泌的神经肽Y(neuropeptide Y NPY)和刺鼠相关蛋白(agouti-related protein，AgRP)可以增强动物食欲，而阿片-促黑素细胞皮质素原(pro-opiomelanocortin，POMC)抑制动物食欲，它们均受味觉系统的调控。血清中的瘦素与下丘脑弓状核神经元上的瘦素受体(OB-Rb)相互作用，可调节NPY、AgRP及POMC等食欲调控基因的表达。布氏田鼠是我国内蒙古草原的主要植食性动物，其所取食的植物含大量次生化合物。本研究以室内繁殖的布氏田鼠为研究对象，用不同剂量（0％、3％及6％，分别为对照组、低剂量组和高剂量组）的单宁酸分四个时间(1d、5d、10d以及20d)连续处理布氏田鼠，用反转录实时荧光定量PCR法(reversetranscription quantitative real-time PCR，RT-qPCR)测定下丘脑弓状核食欲调控基因的mRNA表达量变化，用免疫组化法(Immunohistochemistry，IHC)测定下丘脑弓状核食欲调控蛋白的表达量变化，用ELISA法测定血清中瘦素水平的变化，以探讨单宁酸对布氏田鼠摄食中枢的影响，阐明单宁酸影响动物取食行为的神经机制，为动植物协同进化提供理论依据。研究结果如下:
　　1、处理1d后，只有高剂量的单宁酸可以抑制雌雄布氏田鼠弓状核NPY和AgRP mRNA的表达，促进POMC mRNA的表达;处理5d和10d后，高低剂量的单宁酸溶液均抑制雌雄布氏田鼠NPY和AgRP mRNA的表达，促进POMC mRNA的表达;处理20d后，高低剂量的单宁酸仍然抑制雌性动物NPY和AgRP mRNA的表达，促进POMC mRNA的表达。而对雄性动物而言，只有低剂量的单宁酸溶液仅促进NPYmRNA的表达。但各剂量的单宁酸对于雌雄布氏田鼠下丘脑弓状核OB-Rb mRNA的表达均无显著影响。
　　2、免疫组化结果表明，处理1d后，仅高剂量的单宁酸使雌雄布氏田鼠下丘脑弓状核POMC的含量增加;处理5d后，高低剂量的单宁酸溶液均抑制雌雄动物NPY的表达，抑制雄性动物AgRP的表达，增加雌性动物POMC的含量。而只有高剂量单宁酸抑制雌性动物AgRP的表达，增加雄性动物POMC的含量;处理10d后，高低剂量的单宁酸均可抑制雌雄田鼠NPY和AgRP的表达，促进POMC的表达;处理20d后，高低剂量的单宁酸仍然抑制雌性田鼠NPY和AgRP的表达，促进POMC的表达;但对雄性田鼠没有显著影响。同样，各剂量单宁酸对于雌雄布氏田鼠下丘脑弓状核OB-Rb的表达无显著影响。
　　3、给雌雄布氏田鼠的口腔舌表面滴灌不同剂量的单宁酸溶液后，在四个处理时间段，对照组、低剂量组和高剂量组的体重之间没有显著差异，表明单宁酸对布氏田鼠的体重无显著影响;
　　4、给雌雄布氏田鼠的口腔舌表面滴灌不同剂量的单宁酸溶液后，在不同的处理时间段，对照组、低剂量组和高剂量组的血清瘦素水平之间没有显著差异，表明单宁酸对布氏田鼠血清瘦素水平无显著影响;
　　结果表明，在处理时间较长或剂量较高时，单宁酸可通过增加下丘脑弓状核POMC并降低NPY及AgRP基因和蛋白水平的表达来调控布氏田鼠的取食行为，而这种调控不通过瘦素介导。

目录

摘要

缩略语词汇表

1 文献综述

1．1 基于植物次生化合物的动植物协同进化

1．2 植物次生代谢物

1．2．1 植物次生代谢物及其对动物的作用

1．2．2 单宁酸及其对动物的作用

1．2．3 单宁酸与味觉系统

1．3 味觉系统及摄食中枢

1．3．1 神经肽Y及其受体的概述

1．3．2 Agouti相关蛋Et(AgRP)

1．3．3 阿片-促黑素细胞皮质素原(POMC)

1．3．4 瘦素及瘦素受体概述

1．4 布氏田鼠

2 研究目的与意义

3 材料与方法

3．1 实验动物

3．1．1 实验动物的饲养

3．1．2 实验动物的分组与处理

3．2 实验仪器

3．3 主要试剂

3．4 主要试剂配制

3．5 实验方祛

3．5．1 布氏田鼠的下丘脑的NPY、AgRP、POMC、OB．rb和β-actin cDNA片段的克隆

3．5．2 实时荧光定量PCR测定目的基因mRNA的相对表达量

3．5．3 免疫组化检测布氏田鼠下丘脑弓状核目的蛋白的表达水平

3．5．4 血清瘦素水平的检测

3．6 数据处理

4 结果

4．1 下丘脑弓状核MPY、AgRP、POMC和OB-rb mRNA转录水平的变化

4．1．1 下丘脑弓状核总RNA的提取

4．1．2 目的基因与内参基因实时荧光定量PCR引物的鉴定

4．1．3 单宁酸对布氏田鼠下丘脑弓状核NPY、AgRP、POMC和OB-rb mRNA转录水平的影响

4．2 下丘脑弓状核NPY、AgRP、POMC和OB-rb表达量的变化

4．2．1 单宁酸对布氏田鼠下丘脑弓状核NPY表达量的影响

4．2．2 单宁酸对布氏田鼠下丘脑弓状核AgRP表达量的影响

4．2．3 单宁酸对布氏田鼠下丘脑弓状核POMC表达量的影响

4．2．4 单宁酸对布氏田鼠下丘脑弓状核OB-rb表达量的影响

4．3 单宁酸对布氏田鼠体重及血清瘦素的影响

4．3．1 单宁酸对雄性布氏田鼠体重及血清瘦素的影响

4．3．2 单宁酸对雌性布氏田鼠体重及血清瘦素的影响

5 讨论

5．1 单宁酸对布氏田鼠下丘脑弓状核NPY、AgRP、POMC和OB-rb mRNA转录水平和翻译水平的影响

5．2 单宁酸对布氏田鼠体重的影响

5．3 单宁酸对布氏田鼠血清瘦素的影响

6 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间论文发表和参加课题情况

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