抗体压下H9N2流感病毒囊膜糖蛋白关键抗原表位氨基酸的变异分析

摘要

禽流感病毒(Avian Influenza Virus AIV)为正粘病毒科(Orthomxoviridae)，流感病毒属(Influenzavirus)，单链负股分节段RNA病毒。根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的遗传进化不同，将HA分为H1-H17共17个亚型，NA分为N1-N10共10个亚型。H9N2禽流感病毒(AIV)是1966年首次在北美被分离到，该病毒经过数十年的演变现在在全世界多个地区的家禽中流行，并且造成地方性流行，一般发病比较温和，有产蛋下降和呼吸道症状，但是如果继发感染其他细菌和病毒可能会导致死亡率升高，给世界养禽业造成了不可估量的损失。而随着H9N2的进化，其宿主范围越来越广，不仅能感染禽类，也能感染猫，猪，雪貂甚至人等多种哺乳动物，引起了H9N2对公共卫生威胁的重视。同时H9N2为高致病性H5N1和H7N9提供内部骨架，这两种病毒都导致了人很高的死亡率，这个更引起了人们对H9N2流感的重视。
　　HA和NA是流感病毒最为重要的两个表面糖蛋白。HA负责与唾液酸受体结合，而NA负责把病毒从细胞表面解离出来达到释放和传播病毒的效果，两者的活性及与唾液酸的相互作用是相互平衡的。H9和N2的结构都已经用X-ray晶体学技术解析出来，但是哪些氨基酸在抗原位点起关键作用并没有很多报道。
　　本研究运用本实验室分离的A/chicken/Jiangsu/x1/2004(H9N2)(X1)株H9N2病毒免疫小鼠，制备抗HA和NA单克隆抗体。通过研究这些单克隆抗体的生物学特性和其与HA和NA结合的部位来确定在抗体产生过程中HA和NA蛋白哪些氨基酸是起关键作用。
　　1.抗H9N2病毒HA和NA单克隆抗体的研制
　　流感病毒RNA聚合酶缺少DNA聚合酶具有的校对功能，导致其复制过程中误码率很高，流感病毒在抗体作用下，病毒为逃避抗体压易出现针对抗体的变异株，这也是流感很难控制的一个原因。基于这一原理用单克隆抗体给其抗体压，病毒很会产生针对抗体的变异，使其失去中和特性，通过比对可以确定抗体与蛋白的结合部位。为确定尽可能多的蛋白抗原表位首先需要制备尽可能多的单克隆抗体。
　　本研究我们应用X1株病毒按常规方法免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合，用感染X1株病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)做间接免疫荧光试验(IFA)检测杂交瘤细胞培养上清。结果:获得16株分泌抗H9N2禽流感病毒单克隆抗体的阳性细胞株，分别命名为1C3、1D1、1G8、2A1、2A8、2G4、2G11、3B10、4G3、5B4、5E10、5G4、6A5、6A10、6B6和6E6。用血凝抑制(HI)试验进一步筛选鉴定其抗HA的活性，结果获得了8株抗H9N2 HA的单克隆抗体，分别是1C3、2G4、3B10、5B4、6A5、6A10、6B6和6E6。用H9N2HA基因构建pcDNA-HA并转染293T细胞，以筛选上述其他HI阴性的杂交瘤细胞上清，结果表明，单克隆抗体2A8能与pcDNA-HA转染表达HA的细胞反应，证明单克隆抗体2A8也为抗HA的抗体，但该抗体的HI为阴性。为检测剩余阳性杂交瘤是否有抗H9N2 NA单克隆抗体，我们用不同亚型禽流感病毒H1N1，H1N2，H9N1感染MDCK细胞进行IFA检测分析，发现上述获得的单克隆抗体1D1和1G8两株均可以与H1N2反应，显示免疫荧光阳性，而不与其他病毒反应，表明这两株抗体为抗H9N2 NA的单克隆抗体。综上所述，本研究通过杂交瘤技术共获得抗H9N2HA的单克隆抗体9株，其中8株为HI阳性，1株HI阴性;获得抗H9N2 NA的单克隆抗体2株。单克隆抗体的研制为进一步研究抗原表位氨基酸分析提供了条件。
　　2.抗体压力下H9N2病毒HA蛋白抗原位点氨基酸变异分析
　　HA是流感病毒最为重要的表面糖蛋白之一，负责与唾液酸受体结合。H9具有5个抗原区域，分别命名为抗原Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ。其中Ⅰ和Ⅱ抗原区域在三聚体的头部，这部位产生的抗体表现出HI现象。
　　上述研究获得单克隆抗体中有8株HI阳性的抗H9N2 HA的单克隆抗体，我们鉴定其亚类都为IgG，用8株抗体的腹水检测HI效价，发现其HI效价都很高，达到211-219。用细胞中和试验证明，这些单克隆抗体具有很好的中和X1株H9N2病毒的能力，中和效价达到1∶5120-1∶655360。利用分离的所有H9N2病毒与这8株单克隆抗体进行HI试验，发现1C3和2G4两株单克隆抗体能与所有试验的H9N2病毒产生很高HI效价，表明这两株抗体可能针对H9N2上HA的保守部位。
　　利用筛选病毒的抗体逃逸株方法，本研究我们开展了在单克隆抗体压力下的表位变化分析，以期筛选获得相应的X1株病毒逃逸株。结果表明，不同单克隆抗体压力下的H9N2存活能力不完全一致，其中病毒在1C3和2G4两株抗体作用下生存能力较弱，经过多次筛选才得到病毒逃逸株。通过精确筛选，共获得9株H9N2病毒相应单克隆抗体逃逸株（其中2G4单克隆抗体压力下产生两株逃逸株）。对单克隆抗体逃逸株HA测序分析，发现了10个氨基酸位点发生变异，变异位置分别在147、153、164、167、168、196、198、200、201和207位点，其中164、167、168、196、198和207等6个位点是第一次报道。这10个位点都位于H9N2 HA的抗原位点Ⅰ和Ⅱ区域，新发现了6个位点位于H3的等同抗原区域B。利用NCBI公布的1563株H9N2病毒HA全序列分析发现，田间野生H9N2病毒的这10个位置都出现不同程度的变异，且这些变异与本研究获得的结果相一致。该研究结果证明，抗体压力下的H9N2HA抗原关键氨基酸位点发生变异是产生免疫逃逸的重要基础，这些结果也为今后的疫苗研制和H9N2监测提供了科学依据。
　　3.抗体压力下H9N2 NA抗原位点氨基酸变异分析
　　NA是流感病毒最重要的表面糖蛋白之一，其结构为四聚体。NA负责把病毒从细胞表面解离出来达到释放和传染的作用。很多抗流感病毒的药物都是针对NA蛋白设计的。
　　本研究以研究内容一的两株抗H9N2 NA的单克隆抗体为研究对象，通过Mu-NANA为底物检测单克隆抗体对NA活性的抑制作用。结果发现，单克隆抗体1G8对H9N2 NA有很好的抑制作用，效价达到25.4μg/mL;而单克隆抗体1D1没有呈现相同的作用。为了进一步验证单克隆抗体1D1在NA中的作用，本研究用酶联凝集素试验(ELLA)对其NA活性的抑制作用进行了检测，结果发现，两株抗体都能抑制NA的活性，抑制活性效价分别为1.8μg/mL和0.4μg/mL。这些结果提示，单克隆抗体1G8能很好地抑制NA活性，针对的位点可能位于NA活性中心附近;而单克隆抗体1D1结合部位距NA活性中心可能较远，不能完全阻止Mu-NANA和NA结合。
　　利用抗H9N2 NA特异性单克隆抗体处理X1株病毒，筛选在抗体免疫压力下的H9N2NA变异逃逸株。结果成功筛选获得单克隆抗体1D1压力下的逃逸株，命名为m1D1;单克隆抗体1G8压力下获得两株逃逸株分别命名为m1G8-1和m1G8-2。将这些逃逸株NA测序分析，结果发现，m1D1出现R338S变异，m1G8-1和m1G8-2分别出现D198N，K199E变异。利用NCBI公布的1130株H9N2的NA全序列分析，发现在这三个位置的氨基酸并不保守，都出现了不同程度的变异，其中198和199位置出现了和逃逸株相同的氨基酸变异。这些结果证明，抗体压力下的NA变异，是禽流感逃逸的主要方式之一;这些结果也为禽流感的进化和检测提供了科学依据。
　　4.单克隆抗体2A8与H9N2 HA结合位点的鉴定
　　HA是流感病毒最为重要的表面糖蛋白之一，具有典型的三聚体结构，大部分针对其头部的抗体都具有HI效价，但是有些针对茎部抗原区域的抗体不具备HI功能，但能有效中和病毒感染;这类抗体一般具有较广的反应谱。
　　本研究我们运用实验内容一制备的HI阴性的抗H9N2 HA单克隆抗体2A8进行中和试验，发现其能很好的中和X1株病毒，中和效价为12.5μg/mL，同时IFA中2A8能很好的与H1N1和H1N2结合，证明这株抗体为广谱性单克隆抗体。应用低浓度的单克隆抗体2A8与H9N2作用，然后筛选相应的逃逸株。结果获得4株H9N2单克隆抗体2A8的免疫逃逸株，序列分析发现，免疫逃逸是由于在HA的270和282两个位点出现了变异而导致，属于H9N2病毒HA抗原Ⅳ区或H3的抗原位点C。利用NCBI公布的1563株H9N2的HA全序列分析发现，在HA的270和282位点出现存在不同程度的变异，其中282位置变异较大，变异率达45％，这两个位点变异与本研究获得的结果相吻合。

目录

摘要

符号说明

综述

1．禽流感病毒的发现和发展

1．1 禽流感病毒的发现

1．2 主要的HPAI爆发事件

1．3 低致病性禽流感研究现状及其对公共安全影响

2．禽流感的结构和编码的蛋白

2．1 禽流感的结构

2．2 聚合酶蛋白(PA，PB1和PB2蛋白)

2．3 血凝素(HA)

2．4 神经氨酸酶(NA)

2．5 核蛋白(NP)

2．6 基质蛋白(M)

2．7 非结构蛋白(NS)

3．HA产生抗体的部位及抗体的特性

3．1．HA头部产生的抗体

3．2 对H1广谱反应的CH65抗体

3．3 不同亚型的中和抗体

3．4 单一loop中和性抗体

3．5 针对茎部的广谱抗体

3．6 中和1组禽流感的抗体

3．7 中和2组禽流感的抗体

3．8 中和所有禽流感的抗体

3．9 B类流感的广谱中和抗体

3．10 总结和展望

研究内容一：抗H9N2病毒HA和NA克隆抗体的研制

1 材料

1．1 病毒

1．2 细胞及实验动物

1．3 培养基

1．4 主要仪器

2．方法

2．1 A／chicken／Jiangsu／x1／2004(H9N2)(X1)病毒扩增

2．2 单克隆抗体研制

2．3 IFA筛选阳性杂交瘤细胞

2．4 杂交瘤细胞亚克隆

2．5 HI试验

2．6 H9N2 HA构建pcDNA-HA转染293T细胞筛分析单克隆抗体

2．7 单克隆抗体与不同毒株的免疫反应性分析

3 结果

3．1 获得多株抗H9N2特异性单克隆抗体

3．2 单克隆抗体HI检测分析

3．3 HI阴性的抗HA单抗的鉴定

3．4 抗NA单克隆抗体的鉴定结果

4．讨论

研究内容二：抗体压力下H9N2病毒HA蛋白抗原位点氨基酸变异分析

1 材料

1．1 病毒

1．2 细胞及实验动物

1．3 培养基

1．4 主要仪器

2 方法

2．1 病毒扩增

2．2 抗体亚类鉴定

2．3 腹水制备

2．4 HA和HI检测腹水效价

2．5 IFA检测腹水IF效价

2．6 MN试验

2．7 逃逸株的制备方法

2．8 野毒株和逃逸株HA测序

2．9 序列分析

3 结果

3．1 抗HA单克隆抗体的亚类鉴定以及腹水抗体效价鉴定

3．2 单克隆抗体的特异性检测

3．3 单克隆抗体的病毒逃逸株

3．4 逃逸株和原始病毒对mAbs的交叉反应实验

3．5 抗体逃逸株的HA基因序列分析

3．6 田间野毒氨基酸的变异分析结果

4 讨论

研究内容三：抗体压力下H9N2 NA抗原位点氨基酸变异分析

1 材料

1．1 病毒

1．2 细胞及实验动物

1．3 培养基及试剂

1．4 主要仪器

2 方法

2．1 亚类鉴定

2．2 腹水制备

2．3 腹水纯化

2．4 HA试验

2．5 MN试验

2．6 抗体逃逸株的制备方法

2．7 野毒株和抗体逃逸株NA序列分析

2．8 序列分析

2．9 NI试验

3 结果

3．1 抗NA单克隆抗体生物学特性

3．2 筛选单克隆抗体的X1株H9N2病毒抗体逃逸株

3．3 单克隆抗体对原始病毒和抗体逃逸株的抑制作用

3．4 抗体逃逸株的测序结果分析

3．5 田间野毒NA氨基酸的变异分析

4 讨论

研究内容四：HI阴性抗HA单克隆抗体与HA结合位点的鉴定

1 材料

1．1 病毒

1．2 细胞及实验动物

1．3 培养基及试剂

1．4 主要仪器

2 方法

2．1 亚类鉴定

2．2 腹水制备

2．3 腹水纯化

2．4 HA试验

2．5 MN试验

2．6 抗体逃逸株的制备方法

2．7 野毒株和抗体逃逸株HA序列分析

2．8 序列分析

3 结果

3．1 2A8单克隆抗体生物学特点

3．2 2A8单克隆抗体的抗体逃逸株

3．3 抗体逃逸株的测序分析

3．4 田间野毒氨基酸的变异结果分析

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文

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