鸡源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR检测及传播机制的初步研究

摘要

随着兽医临床菌株耐药性逐年上升，多重耐药及泛耐药现象越来越严重。但是新兽药的研发进展较缓慢，价格昂贵，对早期特别是不容易引起耐药性的药物的重新应用可作为控制多重耐药菌株导致的疾病的首要选择。本论文初步研究了鸡源大肠杆菌中质粒介导氟苯尼考耐药基因floR的流行状况和传播机制，为减少氟苯尼考耐药菌株的出现和减缓耐药的程度提供依据，为解决兽医临床耐药性传播问题提供新思路。
　　本研究对2013～2014年分离自常州地区的80株鸡源大肠杆菌，首先，采用PCR方法检测质粒介导氟苯尼考耐药基因floR，并以微量肉汤稀释法测定80株大肠杆菌对阿莫西林、氟苯尼考、黏菌素、链霉素、恩诺沙星、多西环素、头孢喹肟、安普霉素的体外最小抑菌浓度。其次，采用大肠杆菌系统进化分群对80株大肠杆菌的亲缘关系进行判定。第三，对78株floR阳性菌株进行接合实验，对得到的疑似接合子通过最小抑菌浓度和PCR两种方法进行鉴定，并分析供体菌、受体菌、接合子三者的最小抑菌浓度以及接合子中floR耐药基因的转移情况。第四，取接合实验成功的菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)并通过Southern杂交等方法研究floR的传播方式以及floR耐药基因的定位。研究结果如下:
　　80株禽源大肠杆菌oR基因检出率为97.50％(78/80)。floR基因在禽源大肠杆菌中具有相当高的流行率。细菌对各药物的耐药率分别为:阿莫西林96.25％(77/80)、氟苯尼考90.00％(72/80)、黏菌素80.00％(64/80)、链霉素75.00％(60/80)、恩诺沙星72.50％(58/80)、多西环素56.25％(45/80)、安普霉素18.75％(15/80)。说明本研究中禽源大肠杆菌对氟苯尼考等大多药物都有显示严重的耐药情况。
　　通过大肠杆菌种族系统进化分析，80株禽源大肠杆菌中，非致病性菌株(A)为35.00％(28/80)、低致病性菌株(B1)35.00％(28/80)、高致病性菌株(B2)2.50％(2/80)和高致病性菌株(D)27.50％(22/80)。
　　78株floR阳性菌株接合实验结果表明，接合实验的接合率为62.83％(49/78)，floR接合子对氟苯尼考的MIC值比受体菌升高了16-32倍，而比供体菌MIC降低了2-8倍。同时发现接合子对阿莫西林、黏菌素、链霉素、恩诺沙星、多西环素、安普霉素的MIC值也发生了相应的变化，由此得出氟苯尼考和其它常见药物的耐药性存在共传递效应。且49株接合子中均含有floR耐药基因。挑取的TM10、TM12和WJ13菌株检测进行脉冲场凝胶电泳(S1-PFGE)并通过Southern杂交，显示耐药基因floR的质粒为大质粒，约为130-210kb左右。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 禽源大肠杆菌的耐药现状

2 氟苯尼考药物的研究进展

2．1 氟苯尼考化学结构和属性

2．2 氟苯尼考药物的作用机制

2．3 氟苯尼考药物的应用发展

3 细菌对氟苯尼考的耐药机制

3．1 酶的灭活作用

3．2 外排泵

3．3 作用靶位的改变

3．4 其他的耐药机制

4 氟苯尼考耐药基因的传播机制

5 本研究的目的意义

第二章 质粒介导的氟苯尼考耐药基因检测及体外抑菌试验

1 材料

1．1 仪器与设备

1．2 主要试剂

1．3 试验菌株

1．4 试验药物

2 试验方法

2．1 细菌的分离和鉴定

2．2 floR耐药基因的检测

2．3 抗菌药物对大肠杆菌MIC的测定

2．4 大肠杆菌种族系统进化分析

3 结果与分析

3．1 floR基因检测结果

3．2 体外抑菌试验结果

3．3 大肠杆菌种族系统进化分析结果

3．4 不同系统进化分群大肠杆菌菌株耐药结果

4 讨论

5 小结

第三章 大肠杆菌质粒介导氟苯尼考耐药基因floR传播机制

1 材料

1．1 仪器与设备

1．2 主要试剂

1．3 试验菌株

2 试验方法

2．1 接合实验

2．2．疑似接合子的鉴定

2．3 floR阳性菌株PFGE分型

2．4 floR阳性菌株的定位

3 结果与分析

3．1 阳性菌的接合试验结果

3．2 floR阳性接合子的耐药基因扩增及药物敏感性结果

3．3 接合子及原菌株的MIC比较

3．4 floR阳性菌定位结果

4 讨论

5 小结

全文结论

参考文献

致谢

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