重组嵌合新城疫病毒载体的构建及其在H7N9和H9N2亚型禽流感疫苗研制中的应用

摘要

H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)在我国呈地方流行性。近年来，优势流行的S基因型H9N2亚型AIV频繁为包括H5N1、H7N9和H10N8在内的新型重组AIV提供内部基因。这些新出现的AIV可同时感染家禽与人类，H9N2亚型AIV在鸡群中的稳定流行是对家禽养殖与公共卫生的双重威胁。此外，H7N9亚型AIV目前在我国禽群中流行范围越来越大，且出现了高致病性的变异病毒，造成了家禽严重的疫病爆发，并对人类健康也带来了巨大的威胁。目前禽流感的防控主要使用灭活疫苗，但是存在疫苗接种费时费力、毒力残留、不能诱导细胞免疫等缺点。因此，研制禽流感弱毒活疫苗十分必要。
　　新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)属于血清1型禽副粘病毒(Avian paramyxovirus serotype-1，APMV-1)，其作为禽病疫苗载体已表达了多个病原体的保护性抗原，并获得了较好的免疫效果。但我国商品鸡群中新城疫(Newcastle disease，ND)母源抗体水平高，限制了NDV载体化疫苗的使用。为解决NDV载体疫苗受母源抗体干扰的难题，本研究以NDV为骨架，将与NDV无血清学交叉反应的血清2型禽副粘病毒（Avian paramyxovirus serotype-2，APMV-2）的主要抗原蛋白，即融合蛋白(Fusion Protein，F)和血凝素-神经氨酸酶蛋白(Hemagglutinin-Neuraminidase Protein，HN)的胞外区替换到NDV基因组的对应部分，获得了一株重组嵌合NDV。在此基础上，再以该嵌合NDV为载体表达当前H7N9和H9N2亚型禽流感流行株的血凝素(hemagglutinin，HA)基因，进而研制出了适合我国商品鸡群使用的H7N9和H9N2亚型禽流感重组活疫苗。
　　1.一株禽副粘病毒血清2型毒株的全基因测序和生物学特性鉴定
　　根据GenBank中提供的APMV-2基因组序列，设计10对引物对APMV-2分离株(APMV-2/T4)进行基因片段的扩增和测序，经序列拼接后获取了该毒株完整的基因组序列。序列分析显示，APMV-2/T4与GenBank中公布的其他APMV-2毒株的基因组序列同源性为68.1～77.6％，F和HN蛋白的氨基酸序列同源性分别为69.5～78.3％和67.5～78.9％。全基因组、F基因和HN基因系统进化分析均表明，APMV-2/T4与3株APMV-2中国分离株属于基因Ⅱ型。APMV-2/T4株基因组具有NDV相似的基因组结构和转录控制元件。其F蛋白的裂解位点(91DKPASR↓F97)具有不连续的碱性残基，与NDV弱毒株的裂解位点相似。APMV-2/T4株生物学特性测定结果显示，APMV-2/T4毒株能够在鸡胚中高效复制且对SPF鸡无致病力，安全性良好。ND母源抗体阳性的商品鸡和SPF鸡免疫APMV-2/T4后，产生的HI抗体的水平相当，免疫3周后HI效价均可达7log2，证明APMV-2/T4在存在ND抗体的情况下，能在鸡体内复制并且能够有效地诱导抗体应答。
　　2.嵌合新城疫病毒载体的构建及抗新城疫母源抗体干扰能力的评价
　　根据APMV-2/T4的基因组序列预测F和HN蛋白的胞外区，并将其替换到基因VIId亚型NDV致弱株AI4基因组的对应位置。通过反向遗传技术成功拯救了嵌合病毒AI4-T4FHN。将AI4-T4FHN连续传代10次，嵌合病毒能够稳定地在鸡胚中高效复制并且毒力较弱。交叉HI实验结果显示，重组嵌合病毒与抗APMV-2的多抗血清的反应性强，而与抗NDV的多抗血清反应性较弱，证明嵌合病毒与NDV之间存在明显的抗原性差异。为了评价重组嵌合病毒抗ND母源抗体干扰的能力，我们分别以AI4-T4FHN和LaSota活疫苗免疫1日龄商品鸡(ND抗体效价为8log2)和SPF鸡。AI4-T4FHN感染后未观察到任何临床症状与病理学损伤，且病毒很快被清除，显示了其作为疫苗载体的安全性。血清学转化测定显示，在SPF鸡中，LaSota活苗和嵌合病毒AI4-T4FHN诱导产生的HI抗体水平相当，均在7.2log2左右;相反，AI4-T4FHN在商品鸡中产生的HI抗体水平为7.0log2，明显高于LaSota诱导的HI滴度(3.2log)，表明LaSota活苗受ND母源抗体影响较大，而嵌合病毒AI4-T4FHN在高水平ND母源抗体的商品鸡中仍然能够有效诱发抗体免疫，显示其不受ND母源抗体干扰。
　　3.表达H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的嵌合新城疫病毒的构建及免疫效力
　　为开发新型H7N9亚型AIV活疫苗，本研究分别以嵌合NDV(AI4-T4FHN)和NDV致弱株AI4为骨架，扩增H7N9亚型AIV的HA基因并将其中与NDV基因终止信号的相似序列(1185AGAAAAAA1192)通过沉默突变的方式去除，将HA基因插入载体病毒基因组磷蛋白(phosphoprotein,P)和基质蛋白(matrix protein，M)基因之间，用反向遗传技术成功拯救出重组病毒AI4-T4FHN-H7和AI4-H7。重组病毒的生物学特性评价显示病毒在鸡胚中均具有较强的复制能力。Western blot和间接免疫荧光实验(Indirect immunofluorescent assay,IFA)实验结果显示，在重组病毒感染的细胞中能够检测到HA蛋白，说明HA蛋白能够在载体中稳定表达。为了提高免疫后H7N9特异性抗体水平，本研究使用两种免疫策略，即用嵌合载体疫苗AI4-T4FHN-H7进行1日龄商品鸡的初次免疫，2周后分别以同源病毒AI4-T4FHN-H7和异源病毒AI4-H7加强免疫。加强免疫2周后发现，异源疫苗加免组的HI抗体效价是同源加免组的1.5倍，但免疫组H7N9特异性HI抗体均较低。用ELISA检测针对H7N9的抗体水平，结果显示，疫苗免疫后能够有效诱导较高水平的H7N9特异性的IgY抗体。攻毒保护实验结果表明，两种免疫方式都能够完全抵抗高致病性H7N9病毒的攻击，但是异源载体加免组排毒动物数量少于同源载体加免组且排毒的时间更短。上述结果表明，以嵌合载体疫苗AI4-T4FHN-H7进行初免，AI4-H7进行加强免疫的免疫策略能够在商品鸡中提供针对高致病性H7N9病毒攻击的有效保护。
　　4.表达H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的嵌合新城疫病毒的构建及免疫效力
　　以嵌合病毒AI4-T4FHN和NDV致弱株AI4为载体，将H9N2亚型AIV的HA蛋白插入载体病毒P和M基因之间，并成功拯救了重组病毒。重组病毒AI4-T4FHN-H9和AI4-H9在鸡胚中有较高的复制效率并且对鸡有很好的安全性。Western blot和IFA实验结果证明HA蛋白能够在载体中稳定表达。AI4-T4FHN-H9在具有较高ND抗体水平的鸡中能有效诱导针对H9N2特异性的HI抗体，且能够显著减少H9N2攻毒后的排毒量。为评价AI4-T4FHN-H9在商品鸡中的免疫效果，分别以AI4-T4FHN-H9和AI4-H9对10日龄商品雏鸡进行免疫。AI4-T4FHN-H9能够克服ND母源抗体对载体病毒的干扰，诱导产生高水平的载体特异性抗体。此外，AI4-T4FHN-H9免疫组的H9N2特异性HI抗体水平在免疫后3周显著高于AI4-H9组和对照组，该重组病毒的成功构建为H9亚型禽流感新型疫苗的研制提供了新的思路。

目录

摘要

符号说明

综述 新城疫病毒疫苗载体研究进展

第一章 一株禽副粘病毒血清2型毒株的全基因测序和生物学特性检测

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 嵌合新城疫病毒载体的构建及其抗新城疫母源抗体干扰能力的评价

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三章 表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的嵌合疫苗的构建和免疫评价

1 材料

2 方法

3．结果

4．讨论

参考文献

第四章 表达H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白的嵌合疫苗的构建和免疫评价

1 材料

2 方法

3．结果

4．讨论

参考文献

全文小结

致谢

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