根癌农杆菌T-复合物招募蛋白编码基因Atu4860启动子活性调控机理的研究

摘要

根癌农杆菌是一种革兰氏阴性植物病原菌，它可以感染受伤植物，引发植物的冠瘿瘤疾病。根癌农杆菌在感受到受伤植物的信号后，以T-复合物的形式将T-DNA转运到植物细胞并整合到植物细胞基因组上进行表达，从而干扰植物细胞的正常分裂而致瘤。在T-复合物转运的过程中，VBP蛋白通过与T-复合物上的ⅥrD2结合发挥着招募复合物到T4SS的功能。位于根癌农杆菌线性染色体DNA上的Atu4860（vbp2）基因是编码VBP蛋白的三个同源基因之一，而且它与农杆菌介导转基因法的转化效率有关。我们期望通过研究vbp2基因启动子的表达调控机制，从分子的角度来探索农杆菌介导T-DNA转化的机理，为解决根癌农杆菌在植物转基因技术中出现的转化效率低等问题提供理论依据，进一步提高T-DNA的转化效率。
　　根癌农杆菌vbp2基因启动子活性调控机理的研究主要分为两个方面:一方面是研究vbp2基因启动子受各诱导因子的诱导情况，为了能够对vbp2基因启动子的调控活性进行准确定量，本实验采用原位替换法，利用同源重组原理将野生型根癌农杆菌C58中线性染色体上vbp2启动子后的vbp2编码框替换为rfp的编码框，使得rfp基因的表达在细菌原位上被vbp2启动子调控，构建的原位替换菌株命名为C58vbp2→rfp。再利用乙酰丁香酮(AS)、pH以及L-鼠李糖(Rha)对原位替换菌株进行诱导实验，以单位细菌总蛋白中的RFP荧光强度定量vbp2基因启动子的活性。结果显示AS、pH以及Rha对vbp2启动子均有一定的调控作用，且AS的最佳诱导浓度为150μM;pH在5.5-7.5范围内，随着pH的升高，vbp2启动子活性也逐渐增强;Rha的最佳诱导浓度在100μM。另一方面是研究vbp2基因启动子的活性调控区域，关键在于确定vbp2启动子上响应各诱导因子的活性调控区域。根据vbp2基因启动子转录因子结合位点的预测结果，对vbp2基因启动子进行不同程度的缩短，再将缩短的启动子与报告基因egfp连接，最终构建成8个不同长度启动子的单荧光报告载体。利用AS和Rha的最佳诱导浓度分别诱导不同长度的vbp2启动子，结果显示，vbp2启动子上响应AS的活性调控区域在vbp2启动子上游的165bp到260bp序列之间，vbp2启动子上响应Rha的活性调控区域在vbp2启动子上游的126bp到165bp序列之间。
　　综合分析可得，AS、pH和Rha对农杆菌vbp2基因启动子的活性均具有一定的调控作用。AS和pH诱导vbp2基因启动子的最佳诱导条件与诱导Vir区基因的最佳诱导条件比较发现，vbp2基因表达的最适条件与Vir区基因表达的最适条件并不完全一致，由此推测vbp2基因的功能与其他Vir区基因的功能也不会是完全一致的，也就是说VBP除了与其它Vir蛋白一起参与T-DNA的转运这项功能外，可能还有其它功能。Rha对农杆菌vbp2基因启动子诱导结果表明Rha可以作为调控vbp2基因转录表达的诱导物，而且对vbp2基因启动子具有正向调控作用。

目录

摘要

符号与缩略语说明

第一章 文献综述

1．1 农杆菌简介

1．1．1 农杆菌生物学特性及分类

1．1．2 Ti质粒的结构与功能

1．1．3 Ⅳ型分泌系统结构与功能

1．1．4 根癌农杆菌介导的T-DNA转化过程

1．1．5 根癌农杆菌在转基因方面的应用情况

1．2 根癌农杆菌T-复合物招募蛋白

1．2．1 VBP生物学特征与功能

1．2．2 vbp2启动子分析情况

1．3 报告基因的选择与应用

1．4 研究内容、目的与意义

1．4．1 研究内容

1．4．2 研究目的与意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验所用菌株、质粒、引物

2．1．2 实验所用培养基与试剂配方

2．1．3 实验所用工具酶与试剂盒

2．1．4 实验所用仪器

2．2 实验方法

2．2．1 构建原位替代菌株C58vbp2→rfp的方法

2．2．2 pCB301Δlr-2R／GA的双荧光报告载体的构建

2．2．3 不同长度启动子单荧光表达载体的构建方法

2．2．4 单位细菌总蛋白荧光强度定量启动子活性的方法

2．2．5 用不同诱导因子分别对vbp2启动子进行诱导的方法

2．2．6 vbp2启动子中响应不同诱导因素的调控区确定的方法

第三章 结果与分析

3．1．1 原位替代菌株的构建

3．2 vbp2启动子受各诱导因子的诱导情况

3．2．1 AS对vbp2启动子活性的影响

3．2．2 pH对vbp2启动子活性的影响

3．2．3 Rha对vbp2启动子活性的影响

3．3 vbp2启动子活性调控区域的确定

3．3．1 双、单荧光报告载体应用于vbp2启动子活性研究中的比较分析

3．3．2 不同长度vbp2启动子单荧光报告载体的构建

3．3．3 vbp2启动子上响应AS的调控活性区域的确定

3．3．4 vbp2启动子上响应Rha的调控活性区域的确定

第四章 讨论

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的学术成果

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