阿奇霉素对哮喘小鼠NF-κBp65表达影响的实验研究

摘要

目的：
　　 通过建立哮喘小鼠模型，检测哮喘小鼠肺组织中NF-κBp65表达水平，探讨NF-κBp65在哮喘发病中的变化及阿奇霉素对其的影响。
　　 方法：
　　 40只BALB/C小鼠随机分为四组：哮喘模型组（A组）、正常对照组（B组）、阿奇霉素组（C组）、地塞米松组（D组），每组各10只。哮喘模型组（A组）：在第0天腹腔注射OVA混悬液0.5mL（含OVA100μg，氢氧化铝凝胶400μg），第7d再以相同的剂量和方法重复致敏1次，至第14d起以10g/LOVA溶液50mL超声雾化激发，每日30min，连续7d。阿奇霉素干预组（C组）：致敏及激发方法同A组，第14d起在雾化吸入OVA后1小时后皮下注射阿奇霉素（希舒美50mg/kg），连续7d。地塞米松干预组（D组）：致敏及激发方法同A组，第14d起在雾化吸入OVA后1小时按2mg/kg皮下注射地塞米松，连续7天。正常对照组（B组）：小鼠第Od和第7d腹腔注射生理盐水0.5mL，第14d起以生理盐水溶液超声雾化，每天30min，连续7d。各组均于末次激发后24小时取材，37℃生理盐水进行全肺灌洗每次1ml，反复3次充分回收灌洗液，共回收约2ml。离心后细胞沉淀用1ml PBS重悬，取少许用于细胞计数，余液再次离心后吸出上清，用少许PBS重悬后涂片，室内晾干后固定，常规HE染色，进行细胞分类计数。4组小鼠眼球摘除采血1-1.5ml，取血清，采用ELISA（酶联免疫吸附）法测NF-κBp65蛋白含量，取右肺组织冷冻（-60℃）后研磨，部分进行NF-κBp65mRNA RT-PCR，部分行免疫印迹法（western blot）检测肺组织NF-κBp65蛋白表达。左肺组织用4％多聚甲醛固定后常规石蜡包埋切片，部分行苏木精.伊红（HE）染色；部分行免疫组化观察肺组织NF-κBp65蛋白表达。
　　 结果：
　　 1.各组小鼠肺组织NF-κBp65 mRNA表达ACD三组肺组织NF-κBp65 mRNA表达均显著高于B组（P<0.05），CD两组肺组织NF-κBp65 mRNA表达均显著低于A组（P<0.05），D组NF-κBp65 mRNA表达小于C组（P<0.05）。
　　 2.各组小鼠肺组织NF-κBp65免疫组化ACD三组NF-κBp65免疫组化灰度值均显著低于B组（P<0.05），CD两组灰度值均显著高于A组（P<0.05），且D组灰度值高于C组（P<0.05）。
　　 3.各组小鼠肺组织NF-κBp65Western Blot表达ACD三组NF-κBp65蛋白表达均显著高于B组，CD两组NF-κBp65蛋白表达均显著低于A组，D组NF-κBp65蛋白表达小于C组。
　　 4.各组小鼠外周血中NF-κBp65蛋白表达ELISA测ABCD各组其外周血中NF-κBp65蛋白含量无统计学差异（P>0.05）。
　　 5.各组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数及分类计数比较哮喘组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞（EOS）绝对值和EOS占细胞总数的百分比（EOS％）均显著高于对照组（P<0.05）；阿奇霉素组与地塞米松组BALF中细胞总数、EOS绝对值和EOS占细胞总数的百分LE（EOS％）显著低于哮喘组（P<0.05）。其中阿奇霉素组中性粒细胞数显著低于地塞米松组（P<0.05）。
　　 6.哮喘小鼠外周血NF-κBp65蛋白与肺组织NF-κBp65 mRNA表达的相关性哮喘小鼠外周血NF-κBp65蛋白与肺组织NF-κBp65 mRNA表达总体无相关性（r=-0.25426；p=0.4784）。.
　　 7.哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒细胞数与肺组织NF-κBp65 mRNA表达的相关性哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒细胞数与肺组织NF-κBp65 mRNA表达总体呈正相关（r=0.816：p=0.004）。
　　 8.哮喘小鼠BALF中中性粒细胞数与肺组织NF-κBp65 mRNA表达的相关性哮喘小鼠BALF中中性粒细胞数与肺组织NF-κBp65 mRNA表达总体呈正相关（r=0.645：p=0.004）。
　　 结论：
　　 1.NF-κBp65参与了哮喘的发病，且肺组织NF-κBp65 mRNA的表达水平可以衡量气道中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的炎症情况。
　　 2.外周血NF-κBp65蛋白的表达不能代表其肺组织NF-κBp65 mRNA的表达，故其不能作为反映气道炎症的指标。
　　 3.阿奇霉素和地塞米松都可以通过降低哮喘小鼠肺组织NF-κBp65 mRNA的表达，起到抗炎作用。阿奇霉素抑制NF-κBp65的表达作用弱于糖皮质激素，但抑制气道中性粒细胞炎症强于糖皮质激素。