抗凋亡蛋白BcL-2在自噬调控以及细胞生存中的机制研究

摘要

目的：抗凋亡蛋白Bcl-2在急性饥饿时，通过与自噬关键蛋白Beclin1的相互作用，抑制Beclin1诱导的自噬，但是在某些情况下，Bcl-2的过表达并不能抑制自噬活性，因此抗凋亡蛋白Bcl-2和自噬之间的关系有待进一步研究。本研究的目的是探讨抗凋亡蛋白Bcl-2在自噬调控中的作用及其在细胞生存和死亡中的意义。
　　 方法：利用血清饥饿和自噬激动剂雷帕霉素(Rapamycin)在人神经母细胞瘤SH-SY5Y中，激活自噬，Western检测自噬相关蛋白Beclin1，LC3，p62和CathepsinD，确定自噬激活模型成功；检测Bcl-2家族蛋白变化；利用siRNAKnockdownBcl-2，或者应用Bcl-2的小分子抑制剂拮抗Bcl-2的功能，用MTT法检测细胞在饥饿下的活力变化，用Annexin-V/PI检测细胞凋亡的改变；加入自噬不同阶段的抑制剂,3-MA，E64D和BafilomycinA1，检测在Bcl-2被下调或被小分子抑制剂拮抗时，血清饥饿诱导的自噬对细胞活力的影响。
　　 结果：利用血清饥饿SH-SY5Y细胞6，12，24,36,48小时，Western检测自噬蛋白Beclin1，LC3，CathepsinD和p62，结果显示Beclinl，LC3和CathepsinD在血清饥饿时均上调，而自噬底物p62在6小时一过性下调，提示自噬被激活；用自噬激动剂雷帕霉素同样激活了自噬；在自噬被激活时，检测到抗凋亡蛋白Bcl-2上调；用siRNA干扰Bcl-2蛋白表达水平，检测到LC3无变化，加入溶酶体抑制剂氯化铵，LC3出现堆积，并且自噬底物p62被进一步降解，提示自噬流量进一步增强；在Bcl-2被下调时，或者应用小分子抑制剂HA14-1和ABT-737拮抗Bcl-2的功能活性时，MTT结果显示，血清饥饿进一步使细胞活力下降，AnnexinV/PI结果显示细胞发生早期和晚期凋亡；泛caspase抑制剂Z-VAD阻断细胞死亡证实部分细胞死亡是凋亡性的；应用自噬不同阶段的抑制剂，E64D和巴普洛霉素(BafilomycinA1)抑制自噬，可以挽救血清饥饿导致的部分细胞死亡。这些结果表明，伴随自噬激活而上调的Bcl-2蛋白能够限制自噬的过度激活和保护营养应激下的细胞死亡，当Bcl-2被下调时，自噬进一步激活，并且细胞发生死亡，这种死亡是凋亡性的，同时又是自噬性，因为caspase的抑制剂和自噬的抑制剂都能够挽救部分细胞死亡。
　　 结论：营养剥夺诱导的自噬激活在生理条件下是保护性的，当Bcl-2下调时，抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白，抗自噬蛋白与促自噬蛋白之间的力量对比发生变化，这时候，上调自噬活性可以导致营养应激条件下的细胞死亡，提示自噬的保护性作用依赖于抗凋亡蛋白Bcl-2，一旦Bcl-2下调或者功能受损，自噬的激活对细胞死亡有贡献。

目录

声明

研究背景

第一部分 抗凋亡蛋白Bcl-2在血清饥饿和rapamycin诱导自噬激活的人神经母细胞瘤SH-SY5Y中上调

一、血清饥饿在人神经母细胞瘤SH-SY5Y中激活了自噬

二、雷帕霉素在人神经母细胞瘤SH-SY5Y中激活自噬

三、抗凋亡蛋白 Bcl-2 自噬激活的人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 中上调

小结

第二部分 Knockdown Bcl-2 时,血清饥饿进一步增强自噬流量

一、血清饥饿在 Bcl-2 下调时激活的自噬标记物 LC3没有明显变化,但自噬底物p62下调

二、Bcl-2 下调时,LC3-Ⅱ在自噬抑制剂NH4CL处理时进一步堆积

小结

第三部分 当 Bcl-2 下调时,血清饥饿导致人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 发生凋亡性死亡

一、人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 中的 Bcl-2 被 Knockdown 时,血清饥饿进一步降低细胞活力,导致细胞发生凋亡性死亡

二、当 Bcl-2 的功能被小分子抑制剂拮抗后,血清饥饿同样降低细胞活力,导致细胞发生凋亡

三、凋亡抑制剂和不同阶段的自噬抑制剂挽救部分细胞死亡

小结

讨论

结论

参考文献

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

参加的学术会议

附录一:综述

附录二:表格. 一些自噬常用术语及其解释

致谢