新型STAT3抑制剂齐福斯尼对多发性骨髓瘤的临床前治疗作用及其机理研究

摘要

研究背景和目的：信号转导与转录激活因子-3（Signal Transducer and Activator of Transcription-3，STAT3）是一个可以被不同的细胞因子受体激活的转录因子，与细胞的增殖、生存、血管生成以及迁移等密切关联。STAT3在多种肿瘤细胞（包括白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等血液肿瘤以及肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多种实体肿瘤）中表达异常升高，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。而抑制STAT3活性，则癌细胞出现凋亡。最近的研究发现，抑制STAT3信号通路可以克服包括视网膜母细胞瘤、肺癌、白血病等多种肿瘤的化学耐药性。在前期研究中，我们发现了一个可以抑制STAT3激活的小分子化合物Kifocitanib-齐福斯尼。因此，本课题旨在明确Kifocitanib对多发性骨髓瘤的作用，并揭示其作用机理。
　　研究方法：
　　（1）利用台盼蓝染色排除法，检测Kifocitanib对多发性骨髓瘤细胞的存活率及增殖的影响；
　　（2）流式细胞术检测Kifocitanib对多发性骨髓瘤细胞凋亡及细胞周期的影响；
　　（3）用Western blotting技术检测与细胞凋亡及周期相关蛋白的表达水平；检测与STAT3信号通路相关的蛋白质表达水平；
　　（4）用免疫荧光染色方法检测p-STAT3蛋白的表达及定位；
　　（5）细胞划痕实验检测 Kifocitanib对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）迁移的影响；
　　（6）动物实验：构建骨髓瘤的裸鼠异种移植肿瘤模型，检测Kifocitanib对裸鼠肿瘤体积大小及裸鼠体重的影响，同时观察Kifocitanib对裸鼠有无毒性作用。
　　研究结果：
　　（1）Kifocitanib对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。分别选用了六种多发性骨髓瘤细胞,对细胞存活和增殖状况的分析表明，KIF对这些细胞的增殖均呈现剂量依赖性的抑制作用。
　　（2）Kifocitanib诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡。通过Annexin V-FITC和PI双染，流式检测发现凋亡细胞所占的比例依浓度升高而显著升高。Western blotting检测结果表明，促进了caspase-3和caspase-9的裂解激活，并活化了PARP。另外，它对凋亡抑制蛋白XIAP的表达也有抑制作用。
　　(3) Kifocitanib影响了细胞周期的进程。应用Western blotting检测多发性骨髓瘤细胞周期相关的蛋白，包括多种Cyclins、CDK4、6、E2F-1和 p-RB。结果显示Kifocitanib均下调了这些蛋白的表达，并呈浓度依赖性；进一步应用流式细胞术检测发现，细胞在G0/G1期所占比例随药物浓度的增加而增多。
　　（4）Kifocitanib抑制了STAT3的活化。Western blot检测表明，Kifocitanib对多发性骨髓瘤细胞STAT3内源性活化和白介素-6（IL-6）刺激引起的STAT3的外源性活化均有抑制作用。免疫荧光染色检测RPMI-8226细胞中p-STAT3的表达，同样证实Kifocitanib对其活化有抑制作用。骨髓基质细胞（HS-5）和骨髓瘤细胞（OPM2 and U266）共培养条件下，Kifocitanib也对STAT3的活化有抑制作用。
　　（5）Kifocitanib阻碍了STAT3的核输出。分离RPMI-8226细胞的胞核、胞浆，分别检测给药后STAT3的表达。结果发现，不论是在全培养条件下还是饥饿时，给药后STAT3在胞核中水平升高，提示Kifocitanib阻碍了STAT3的核输出。
　　（6）Kifocitanib抑制了STAT3信号通路的进行。通过对STAT3上、下游信号的激活情况的检测表明，Kifocitanib抑制了STAT3上游JAK2、c-Src的磷酸化水平，并下调了下游靶蛋白（Mcl-1、Bcl-2、CCND2、VEGF等）的表达。
　　（7）Kifocitanib抑制了细胞的迁移。选用人血管内皮细胞（HUVEC）为研究对象，采用细胞划痕实验方法检测证实，Kifocitanib能明显抑制细胞的迁移。
　　（8）Kifocitanib抑制了体内肿瘤的生长。我们构建了一个裸鼠体内骨髓瘤的异种移植模型，通过14天连续给药对其肿瘤体积大小和体重的监测发现， Kifocitanib能明显抑制肿瘤的生长，而对其体重无明显影响。Kifocitanib也抑制了肿瘤组织中STAT3的表达及其活化。
　　结论：我们在国内外最先发现 Kifocitanib具有抗多发性骨髓瘤的活性，其通过抑制 STAT3的活化来引起下游靶基因蛋白表达抑制，阻滞细胞周期，从而诱导细胞凋亡。这一研究结果提示Kifocitanib可以成为治疗MM疾病的强有力的候选药物.

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封面

中文摘要

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前言

材料与方法

一、材料

二、方法

结果

第一部分 Kifocitanib对MM细胞STAT3的影响研究

第二部分 Kifocitanib对MM细胞的增殖的作用及在凋亡、周期中的作用研究

第三部分 Kifocitanib的体内抗MM肿瘤的活性研究

总结

结论及展望

参考文献

综述

参考文献

硕士期间待发表的论文及专利

缩略词表

致谢