NKT细胞对不同严重程度支气管哮喘的实验研究

摘要

目的：建立不同严重程度支气管哮喘的小鼠模型，并在此基础上研究自然杀伤T细胞（Natural killer T cells，NKT）在不同严重程度支气管哮喘小鼠的作用，初步揭示NKT在支气管哮喘发病中的机制，进而为探索支气管哮喘治疗的新方法奠定一定基础。
　　方法：利用不同浓度卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）激发致敏小鼠，建立不同严重程度支气管哮喘小鼠模型，并利用α-半乳糖神经酰(α-galactosylceramide，α-Galcer)激活NKT细胞对不同严重程度支气管哮喘进行干预。将雌性BALB/c小鼠随机分为5组，即生理盐水（Normal saline，NS）组，1％OVA组、1%OVA+α-Galcer组，5%OVA组，5%OVA+α-Galcer组。于0d、14d给予各处理组小鼠腹腔注射OVA溶液致敏，同时NS组注射NS溶液做对照。在第25天雾化激发前1小时，NS组、1%OVA组和5%OVA组中每只小鼠用移液枪鼻腔滴入 NS，1%OVA+α-Galcer组和5%OVA+α-Galcer组中每只小鼠用移液枪鼻腔滴入α-Galcer。第25，26，27天雾化吸入OVA进行激发，NS组予NS雾化，1%OVA组和1%OVA+α-Galcer组予1%OVA雾化，5%OVA组和5%OVA+α-Galcer组予5%OVA雾化，雾化期间观察小鼠行为学改变。最后一次雾化24小时后，用Buxco小鼠肺功能仪有创肺阻抗法测定小鼠的气道反应性（Airway hyper reactivity，AHR）；然后眼球取血，应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清OVA特异性IgE；并进行肺部灌洗，收集肺泡灌洗液（Bronchial lavage fluid，BALF），利用全自动细胞计数仪器记录肺泡灌洗液中细胞总数。流式细胞术检测BALF中各类细胞（包括中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞（Eosinophil，EOS））的比例。CBA法检测小鼠BALF中细胞因子γ-干扰素（interferon，IFN-γ），白介素（Interleukin，IL）-4、-5和-13的水平。HE染色支气管肺组织切片观察气道炎症病理变化，根据血管、气道周围以及肺间质炎性表现情况不同进行评分(分值为0-3分)。
　　结果：1.不同严重程度支气管哮喘模型建立： NS组小鼠在雾化15min后出现轻微烦躁；1%OVA组小鼠在雾化8min出现烦躁不安、呼吸加深加快、频繁抓口鼻和四肢、弓背直立、前肢缩抬行为学改变；5%OVA组小鼠雾化5min后出现上述更为明显症状。1%OVA组和5%OVA组小鼠肺组织病理改变、BALF中细胞总数及EOS比例、BALF中IL-4,-5,13水平、血清OVA特异性IgE水平和气道阻力较NS组明显升高（P<0.05或P<0.01），且5%OVA组较1%OVA组升高更为明显（P<0.05或P<0.01）。2.α-Galcer干预后不同严重程度支气管哮喘小鼠的行为学观察：NS组小鼠在雾化15min后出现轻微烦躁及抓耳挠腮的症状；1%OVA组在雾化8min出现烦躁不安、呼吸加深加快、频繁抓口鼻和四肢、弓背直立、前肢缩抬等症状；1%OVA＋α-Galcer组雾化10min后出现上述症状，程度减轻；5%OVA组在雾化5min后出现烦躁不安、呼吸加深加快、频繁抓口鼻和四肢、弓背直立、前肢缩抬、点头呼吸、大小便失禁等；5%OVA＋α-Galcer组的在雾化8min后出现上述症状，程度减轻。3.α-Galcer干预后不同严重程度支气管哮喘小鼠的组织病理学表现：NS组小鼠支气管、血管周围及肺间质炎性细胞无明显浸润；与NS组相比，1%OVA组炎性细胞轻度浸润，见少许EOS，支气管管腔不规则，肺泡腔融合，差异明显（P<0.05）；同1%OVA组相比，1%OVA+α-Galcer组有少许炎性细胞浸润，几乎无EOS浸润，有显著性差异（P＜0.01）；5%OVA组炎性细胞明显浸润，可见大量EOS，支气管管腔不规则且狭窄明显，周围血管充血水肿，肺泡腔融合进一步扩大（P<0.01）；同5%OVA组相比，5%OVA+α-Galcer组弥漫炎性细胞浸润，大量的EOS，支气管管腔不规则且狭窄明显，肺泡腔融合，无明显统计学差异。4.α-Galcer干预后不同严重程度支气管哮喘小鼠的BALF中细胞总数及EOS的改变：相对于NS组而言，不同浓度的OVA组小鼠BALF中细胞总数均明显升高，同时5%OVA组BALF中细胞总数升高最多。对于不同严重程度的支气管哮喘小鼠，α-Galcer治疗均能有效降低BALF中的细胞总数（P<0.05）。5%OVA组小鼠的BALF中EOS比例较NS组、1%OVA组升高(P<0.01)，但1%OVA组与NS组无明显差异（P＞0.05），α-Galcer治疗能够降低1%OVA激发组BALF中EOS的比例（P＜0.05），但在5%OVA激发组中没有观察到明显效果。5.α-Galcer干预后不同严重程度支气管哮喘小鼠BALF中细胞因子水平检测：与NS组比较，不同浓度OVA激发能不同程度地升高小鼠BALF中IL-4，-5和-13的水平，同时降低BALF中IFN-γ的水平。α-Galcer治疗能明显降低1%OVA激发组模型小鼠BALF中IL-4和IL-5的水平，升高IFN-γ的水平，但对5%OVA组小鼠作用较弱，无显著性差异。6.α-Galcer干预后不同严重程度支气管哮喘小鼠气道反应性检测：当组胺浓度为4mg/ml、8mg/ml时，1%OVA组和5%OVA组小鼠的气道阻力较NS组明显升高（P＜0.01），低剂量组胺刺激时，5%OVA组较1%OVA组小鼠的气道反应性明显升高（P＜0.05），而在高浓度组胺刺激时，两组间无明显差异(P＞0.05)；用不同浓度组胺刺激时，α-Galcer治疗均能有效降低各模型组小鼠的气道反应性。
　　结论：1.1%OVA和5%OVA可以诱导建立小鼠不同严重程度支气管哮喘模型。2. NKT细胞对1%OVA激发的较轻严重程度支气管哮喘的小鼠能改善其行为学、抑制气道炎症水平及减轻气道阻力；而对5%OVA激发的严重程度较重的支气管哮喘的小鼠作用较弱。

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前言

第一部分 不同浓度的卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏小鼠构建不同严重程度的支气管哮喘模型

材料与方法

结果

小结

第二部分 NKT细胞对不同严重程度支气管哮喘的小鼠的影响研究

材料与方法

结果

小结

讨论

实验不足及展望

结论

参考文献

综述:自然杀伤T细胞(Natural killer T cells,NKT)对支气管哮喘的作用

中英文对照缩略表

攻读学位期间公开发表的论文

致谢