巴弗洛霉素A1实验治疗儿童b-急性淋巴细胞白血病

摘要

目的:
　　B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)是最常见的儿童白血病。目前儿童B细胞急性淋巴细胞白血病的治疗方案往往与中枢神经系统的副作用和复发有关。因此，需要更有效、更安全的药物。Bafilomycin A1(Baf-A1)是一种大环内酯类抗生素，已用于临床治疗索氏梭菌引起的败血症，但尚未见于实体瘤的临床治疗应用，也未见于白血病的治疗研究。本课题旨在研究Baf-A1对B-ALL的实验治疗作用，并探讨其作用机制，为其研发成为B-ALL靶向治疗新药提供临床前实验研究数据和理论依据。具体目标:(1)明确Baf-A1对B-ALL细胞的特异性杀伤作用;(2)确定Baf-A1对B-ALL动物模型的治疗作用;(3)明确Baf-A1靶向B-ALL患者原代细胞的临床意义;(4)探索Baf-A1实验治疗B-ALL的分子机制。
　　方法:
　　首先，通过CCK8检测Baf-A1对B-ALL细胞生长的影响，流式CFSE检测对细胞增殖的影响，流式PI检测对细胞周期的影响，流式PI/AnnexinⅤ双染检测对细胞凋亡的影响等，确定体外细胞水平Baf-A1对B-ALL的抑制作用。
　　其次，通过CCK8检测Baf-A1对B-ALL患者原代细胞生长的影响，以及流式PI/AnnexinⅤ双染检测对患者原代细胞凋亡的影响，确定Baf-A1抑制B-ALL的临床意义。
　　然后，建立B-ALL小鼠模型。4周龄雄性NOD/SCID小鼠饲养于SPF动物房。将处于指数生长期的标记了GFP的697细胞（5～10×106个细胞/0.2 ml）经尾静脉注射到NOD/SCID小鼠体内。观察小鼠体重、饮食和活动性等情况变化，第四周处死NOD/SCID小鼠。B-ALL小鼠模型成功建立的评定标准:a）体重、活动量、饮食水量下降;b）出现肢体瘫痪小鼠;c）外周血、骨髓中白细胞数量和比率升高，血涂片可见大量幼稚细胞;d）肝、脾、胃等组织有大量白细胞浸润;e）血液和骨髓中能检测出E2A/Pbx1融合基因表达。
　　在成功建模基础上，研究Baf-A1对B-ALL小鼠的治疗效果。NOD/SCID小鼠分为四组:对照组(C)、发病组(M)、治疗组1(T1)和治疗组2(T2)。治疗组注射697细胞一周后再注射Baf-A1。其中，治疗组1:NOD/SCID小鼠腹腔注射0.1 mg/kg Baf-A1。治疗组2:NOD/SCID小鼠腹腔注射1 mg/kg Baf-A1。同时，对照组和发病组:NOD/SCID小鼠注射生理盐水。所有各组均每天一次，连续3天给药。治疗效果的评定标准:a）延长小鼠生存时间;b）降低出现肢体瘫痪小鼠的比率;c）缓解白血病细胞对组织的浸润; d）外周血象、骨髓象恢复。
　　此外，我们使用C57BL/6J小鼠为模型初步进行了毒力测定。将小鼠分为6组，分别给予注射不同浓度的Baf-A1:0.1、1、5、10、25 mg/kg，同时将1组设为对照组给予注射相应剂量的乙醇（Baf-A1的溶剂）。注射两周后没有小鼠发生死亡。每隔一天称量一次体重。在注射Baf-A1后的第14天将小鼠全部处死，取外周血细胞做血象分析，取各组织做比重分析，取肝组织做病理观察。
　　进而，我们通过免疫印迹、成像流式分析、共聚焦成像、siRNA干扰等实验手段，初步探索了Baf-A1特异性杀伤B-ALL细胞的分子机制。
　　结果:
　　一、Baf-A1特异性抑制B-ALL细胞系增殖，而对髓系白血病细胞和正常骨髓细胞的生长和活性没有明显影响。对白血病小鼠模型的研究表明，Baf-A1可以有效治疗B-ALL，降低死亡率，减弱白血病细胞对肝、脾的浸润。C57小鼠体内毒性试验表明，治疗剂量下的Baf-A1是安全的。Baf-A1的选择性杀伤作用在B-ALL患者原代细胞上也获得证实。
　　二、Baf-A1是H+-ATPase酶的抑制剂，在高浓度下，常用于抑制晚期自噬。在本课题研究中，我们首次发现Baf-A1在低浓度(1 nM)下除了能够通过抑制自噬体和溶酶体的融合从而抑制晚期自噬之外，还能通过激活mTOR信号通路，并通过干扰Beclin1-Vps34复合体的形成，抑制早期自噬途径。
　　三、Baf-A1通过改变线粒体的膜势能，使位于线粒体膜间隙的AIF变成可溶性的蛋白，释放到胞浆，然后入核，最终诱导了caspase非依赖型的细胞凋亡。此外，Baf-A1诱导Beclin1-Bcl-2复合体的增多，进一步抑制细胞自噬和诱导细胞凋亡。
　　结论:
　　Baf-A1能特异、高效地杀伤体内外的B-急性淋巴白血病细胞，对正常细胞无毒副作用，因此，Baf-A1可望应用于白血病治疗的临床试验。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 巴弗洛霉素A1靶向B-急性淋巴细胞白血病的作用研究

1．材料与方法

2．结果

2．1 Baf-A1体外特异性抑制儿童B-ALL细胞生长和增殖

2．2 Baf-A1特异性抑制儿童B-ALL病人原代细胞的生长

2．3 Baf-A1对人白血病细胞异种移植小鼠模型有明显的治疗作用，可减缓其白血病进程

2．4 体内毒力测定实验表明在治疗剂量下Baf-A1无毒副作用

3 讨论

第二部分 巴弗洛霉素A1靶向B急性淋巴细胞白血病的机制探讨

1．材料与方法

2．结果

2．1 Baf-A1减缓B-ALL细胞周期进程

2．2 Baf-A1在低浓度下可通过多个靶点有效抑制B-ALL细胞的自噬

2．3 Baf-A1通过凋亡诱导因子介导的非经典凋亡通路诱导儿童B-ALL细胞的死亡

3．讨论

结论

参考文献

综述 B-急性淋巴细胞白血病的研究现状

博士学位期间公开发表的论文

附录

中英文缩略词汇表

致谢