猪圆环病毒2型人工感染和重组腺病毒基因工程疫苗研究

摘要

本研究在临床征状和病理学观察的基础上用PCR方法，对2002年1月-2002年12月江苏、上海、山东、江西、安徽和浙江等省市的100家猪场146例患有断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的猪肺脏和淋巴结，进行了PCV2和PRRSV基因检测，发现24家猪场28例病料为PCV2阳性，64家猪场77例病料为PRRSV阳性，其中19家猪场21例病料同时感染了PCV2和PRRSV。从送检的病料中分离到两株PCV2，即PCV2-SH和PCV2-AH。经PCR扩增部分ORF2基因和序列分析，结果显示，两个分离株部分ORF2与国外分离毒株同源性为92％-99％，两个分离株部分ORF2基因存在一定差异。表明我国PMWS患病猪群广泛存在PCV2感染，而且大部分同时感染了PRRSV；不同地区PCV2存在一定基因差异，它们可能来源于不同国家或地区。 将24头断奶仔猪(32日龄)随机分为6组即PCV2攻毒后KIH刺激组、PCV2+PRRSV混合感染组、PCV2攻毒组、PRRSV攻毒组、钥匙孔血蓝蛋白(KLH)刺激组和对照组。每组4头，进行PCV2攻毒试验。攻毒后隔离饲养，观察临床征状并对濒死猪进行病理解剖。攻毒后不同时间采血或组织脏器，用PCR和RT-PCR检测病毒。结果为空白对照组和KIH刺激组未出现临床征状，PCV2和PRRSV攻毒组仅表现短暂的体温升高，而PCV2攻毒KLH刺激组和PCV2+PRRSV混合感染组出现明显的临床征状，其中PCV2攻毒后KLH刺激组的2头猪在攻毒后11天濒临死亡，宰杀后脏器出现明显的病理变化，各攻毒猪于攻毒后四天出现病毒血征，宰杀后肺脏、淋巴结均检测到PCV2和PRRSV。以上结果说明PCV2是引起PMWS的主要病原，KIH是PMWS的重要诱因。PCV2和PRRSV混合感染可引起PMWS。本研究成功复制了PMWS，为该病免疫预防研究奠定了重要基础。 PCV2是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的必需病原，含 博士学位论文：猪圆环病毒2型感染和重组腺病毒基因工程疫苗的研究有两个主要的阅读框ORF1和ORF2，分别编码复制相关蛋白(Rep蛋白)和核衣壳蛋白(cap蛋白)，其中Cap蛋白含有病毒主要抗原表位，是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV)，并与腺病毒骨架载体(pAdEasy-1)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞，经3次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap，测定其TCID<,50>为10<'13.0>／mL。用RT-PCR、间接ELISA、Western blot和IPMA等试验证明了Cap蛋白在该重组腺病毒感染的293A细胞中获得表达。为了进一步研究重组病毒rAd-Cap的免疫特性，分别进行了小鼠和猪体试验。取100只6-8周龄的清洁级小鼠，随机分为五组，每组20只，第1、2和3组每只小鼠分别皮下注射10<'8>、10<'10>和10<'12>TCID<,50>重组腺病毒rAd-Cap，第4组每只小鼠皮下注射10<'8> TCID<,50>空的腺病毒(wild Ad)，第5组每只皮下注射0.3mL灭菌PBS，两周后按相同方法加强免疫1次，隔离饲养，并分别在二免后10、20、30和40天，每组取5只小鼠宰杀，采集血清，测定抗体和中和抗体；同时无菌取其脾脏，进行淋巴细胞转化试验。结果为各组免疫小鼠在二免时能检测到ELISA抗体，中和抗体滴度均<1:4，二免后40天时，10<'8>，10<'10>和10<'12>TCID<,50>组的ELISA抗体平均滴度分别为1:2200，1:4800和1:6400，中和抗体平均滴度分别为1:8，1:14和1:17。Western blot试验结果表明，免疫小鼠血清中存在PCV2特异性抗体。淋巴细胞转化试验结果为二免后30和40天各组小鼠刺激指数均升高。为了进一步研究重组病毒对猪体的免疫特性，取9头(同窝)32日龄PCV2阴性普通断奶仔猪，随机分为3组，每组3头，第一组为免疫攻毒组；第二组为非免疫攻毒组；第三组为空白对照组。免疫组每头猪皮下注射3.5×10<'10>TCID<,50>重组病毒，首免后第17天加强免疫1次。首免后10、17、27和37天分别采血，测定ELISA抗体和中和抗体。除空白对照组外，其余猪在第37天攻毒PCV2，攻毒后4、7和11、19天用钥匙孔血蓝蛋白(KLH)和巯基乙酸培养基进行免疫刺激，隔离饲养观察，32天后全部宰杀。结果为免疫猪在首免后10天即出现抗体，第27天中和抗体滴度为1:35，第37天ELISA抗体可达1:6400，中和抗体滴度为1:48。攻毒后，免疫猪无明显临床征状，增重与空白对照比较没有显著差异，免疫攻毒组仔猪病毒血征持续25天以内，而非免疫攻毒组有明显的异常临床表现，增重缓慢，体温升高，病毒血征持续32天以上。上述结果表明，该重组腺病毒rAd-Cap可以诱导小鼠产生明显的体液免疫和细胞免疫应答，并可诱导猪体产生免疫保护反应，可以作为PCV2基因工程疫苗的候选毒株，从而为有效预防该病奠定了基础。 临床上PCV2与PRRSV混合感染引起的PMWS较常见，死亡率和发病率很高，但目前尚无能有效预防该病的商品化疫苗。本研究将PCV2 Cap蛋白基因克隆入已经含有PRRSV GP5蛋白基因的穿梭载体rShuttle-ORF5中，然后与骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组，挑选阳性重组质粒rAd-ORF2-ORF5，线性化后转染HEK-293A细胞，多次纯化获得重组腺病毒rAd-Cap-GP5。经IPMA、IFA和Western blot证明重组病毒同时表达了Cap蛋白和GP5蛋白。分别通过小鼠和猪体试验进一步研究了表达PCV2 Cap蛋白和PRRSV-GP5融合蛋白重组腺病毒免疫特性。(1)小鼠免疫试验：取40只6～8周龄的清洁级雄性小鼠，随机分为2组，每组20只。第一组背部皮下多点注射2.5×10<'9.0>TCID<,50>重组腺病毒rAd-Cap-GP5，第二组每只小鼠皮下注射10<'8>TCID<,50>空的腺病毒作为阴性对照。首免后2周用相同的方法加强免疫1次，隔离饲养，并分别在一免后2、4、6和8周，采集血清测定PCV2和PRRSV的ELISA抗体和中和抗体。二免后35天，每组取五只小鼠宰杀，取其脾脏，分离淋巴细胞，测定IFN-γ。结果为首免后2周免疫组即出现抗体，N二免后2周PCV2和PRRSV ELISA抗体水平分别为l：2400和1：3800，PCV2和PRRSV特异性中和抗体效价为1：14和1：4，二免后4周和6周PCV2中和抗体基本保持不变，而PRRSV中和抗体水平分别上升至1：10和1：12。二免后35天，免疫小鼠的IFN-γ表达水平明显高于对照组小鼠。(2)猪体免疫攻毒保护试验：取15头32日龄PCV2和PRRSV阴性断奶仔猪，随机分为5组，每组3头。第一组为免疫攻毒PCV2组；第二组为免疫攻毒PRRSV组；第三组为非免疫攻毒PCV2组；第四组为非免疫攻毒PRRSV组；第五组空白对照组。免疫组每头猪皮下注射5×10<'10>TCID<,50>重组腺病毒，第17天重复免疫1次，隔离饲养观察。首免后10、17、27和37天分别采血，测定ELISA抗体和中和抗体。第37天进行攻毒，免疫和非免疫PCV2攻毒组每头猪滴鼻5×10<'5>TCID<,50>的PCV2-SH，免疫和非免疫PRRSV攻毒组每头猪滴鼻3.5×10<'55>TCID<,50>的PRRSV。在攻毒后第4、7和11、19天PCV2攻毒组用钥匙孔血蓝蛋白和巯基乙酸培养基进行免疫刺激。在攻毒前和试验结束时称量各头猪的体重，攻毒后测定猪体温，并于攻毒后第4、11、18、25和32天采集血清，测定PCV2和PRRSV病毒血征持续时间。结果为：一免后第10天即可出现PCV2和PRRSV特异性ELISA抗体，第37天ELISA抗体效价分别达到1：6400和l：13400，中和抗体分别达到1：52和1：45。免疫猪无明显临床异常表现，与非免疫攻毒组比较增重快，与空白对照组相似，而非免疫攻毒猪有明显临床表现，增重缓慢。非免疫组攻毒组在攻毒后的整个过程可以检测到PCV2和PRRSV，而免疫组在攻毒后25天病毒血征已全部消失。上述结果表明，重组腺病毒rAd-Cap-GP5可以诱导小鼠产生明显的体液免疫和细胞免疫应答，并可诱导猪体产生免疫保护反应，可以作为预防PCV2-PRRSV混合感染的基因工程疫苗候选毒株。 通过本研究结果表明，在我国华东地区存在PMWS，分离株PCV2-SH对猪具有致病性，能引起断奶仔猪发生PMWS。根据PCV2和PRRSV基因的免疫特性，们成功构建了重组病毒rAd-Cap和rAd-Cap-GP5。免疫动物后结果表明，这两株重组病毒可以诱导产生免疫反应，对猪有一定的保护力。因此，重组病毒rAd-Cap和rAd-Cap-GP5有发展为预防PCV2相关疾病疫苗的潜力，但要用于生产还需要进一步的研究。此研究为PCV2重组亚单位疫苗的研究奠定了一定的基础。

目录

文摘

英文文摘

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第一章猪圆环病毒研究进展

第二章断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）

第三章断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）分子流行病学调查

第四章猪圆环病毒2型（PCV2）人工感染与PMWS的复制

第五章猪圆环病毒2型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定

第六章猪圆环病毒2型Cap蛋白重组腺病毒免疫特性的研究

第七章PCV2 Cap和PRRSV GP5融合蛋白重组腺病毒的构建和鉴定

第八章PCV2 Cap和PRRSV GP5融合蛋白重组腺病毒免疫特性的研究

全文总结

致谢

攻读学位期间发表的论文