植物源化合物肉桂醛对辣椒疫霉抑菌活性研究

摘要

辣椒疫霉（P.capisici）属于卵菌纲病原菌，它所引起的辣椒疫病是辣椒生产中的一种毁灭性病害，可以侵染包括茄科和葫芦科在内的多种作物。植物源化合物肉桂醛(Cinnamaldehyde)是一种具有天然抑菌活性的小分子物质，具有杀菌、抗病毒、防腐和保鲜等作用，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。本实验室通过研究发现，肉桂醛对辣椒疫霉有较好的抑制作用。本研究以辣椒疫霉和肉桂醛为研究对象，主要从以下三方面展开研究。
　　第一，肉桂醛对辣椒疫霉的抑制作用以及田间防效。研究表明，肉桂醛有效抑制辣椒疫霉菌丝生长的EC50值为0.75 mM，肉桂醛对辣椒疫霉孢子的最低抑制浓度(MIC)为0.4 mM。肉桂醛对辣椒疫病的田间防效高达81.73％，与对照组甲霜灵处理(50.63％)相比，提高31.1％。
　　第二，肉桂醛介导辣椒疫霉细胞内的Ca2+外排。试验发现，肉桂醛处理辣椒疫霉孢子导致细胞内Ca2+瞬间减少。通过电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)检测到细胞外Ca2+含量显著上升，表明肉桂醛处理孢子引发细胞内Ca2+的外排。进而使用细胞内Ca2+通道抑制剂（异搏定和钌红），发现肉桂醛处理孢子引发Ca2+外排的同时伴随Ca2+内流现象，但内流程度远小于外排程度。用Ca2+专一性螯合剂EGTA将细胞内游离Ca2+螯合后，孢子的生长状况明显受到抑制。使用肉桂醛类似物、不合α,β-不饱和双键的苯丙醛处理孢子，其生长并未受到抑制，细胞内Ca2+并未呈现外排现象。当外源添加加成反应的拮抗剂半胱氨酸(Cys)时，辣椒疫霉孢子的生长能够明显得到缓解，并减弱Ca2+外排。上述结果表明，肉桂醛的α,β-不饱和双键在抑制辣椒疫霉中起到重要的作用。进而推测，肉桂醛抑制辣椒疫霉可能是通过它的α,β-不饱和双键发生的迈克尔加成反应引发的Ca2+外排。
　　第三，由于肉桂醛难溶于水、容易氧化等性质，容易引起在实际应用中药效的降低，增加实际应用中的难度。本研究对其进行纳米化修饰，形成一种透明、低黏度的动力学和热力学稳定体系，并将纳米化前后的肉桂醛对辣椒疫霉的抑菌活性进行对比。通过试验发现，纳米化肉桂醛具有良好的水溶性和稳定的分散性，平均粒径为38.9μm，通过透射电镜(TEM)观察，大部分呈现出规则的球型且分布均匀，具有很好的冷热稳定性，抑菌效果有了进一步的提升。纳米化肉桂醛在终浓度达到0.2 mM时，可以抑制辣椒疫霉孢子的生长，当终浓度达到0.3 mM时便可以有效地抑制孢子的生长，与等浓度的肉桂醛处理相比，抑菌活性有所提高。同样，与等浓度的肉桂醛处理对比，纳米化肉桂醛处理辣椒疫霉孢子，引发了更强烈的Ca2+外流。以上结果表明，纳米化肉桂醛的稳定性和抑菌活性较非纳米化肉桂醛显著提高。
　　综上所述，肉桂醛可以显著抑制辣椒疫霉生长，在田间表现出较好的防效。这种抑制作用可能是由于肉桂醛的α,β-不饱和双键与钙泵型Ca2+-ATPase的半胱氨酸巯基发生迈克尔加成反应，激活该钙泵，引起Ca+的外排，从而抑制辣椒疫霉的生长，该通道蛋白可能成为新药物靶标筛选的依据。纳米化肉桂醛具有较好的水溶性和稳定分散性，粒径小且分布均匀，抑菌活性更强，这些研究结果可以为肉桂醛的实际应用提供基础，同时也为纳米化制剂的开发提供一定理论和实践基础。

目录

声明

摘要

符号及缩略词

第一章 文献综述

1 辣椒疫病及其危害

1．1 辣椒疫霉

1．2 繁殖方式及侵染发病

1．3 辣椒疫病引起的危害

2 辣椒疫病的防治现状

2．1 使用抗性品种

2．2 合理的栽培管理

2．3 化学防治

2．4 生物防治

3 细胞内Ca+的研究

4 肉桂醛的研究进展

4．1 肉桂醛的理化性质

4．2 肉桂醛的生物活性

5 纳米化制剂的研究进展

6 试验研究目的和意义

第二章 肉桂醛对辣椒疫霉的抑菌活性及田间防效

引言

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 肉桂醛对辣椒疫霉的活性

2．2 肉桂醛对辣椒疫霉菌丝的致死效应

2．3 肉桂醛对辣椒疫霉孢子的抑制作用

2．4 肉桂醛处理辣椒疫霉孢子活力的测定

2．5 肉桂醛对辣椒疫病的田间防治效果

3 小结

第三章 肉桂醛抑制辣椒疫霉的作用机制研究

引言

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 肉桂醛处理辣椒疫霉孢子胞内Ca2+的变化

2．2 肉桂醛处理辣椒疫霉孢子胞内Ca2+的内流

2．3 Ca2+参与辣椒疫霉孢子生长调节的重要性

2．4 肉桂醛的α，β不饱和双键参与胞内Ca2+外排的重要性

3 小结

第四章 纳米化肉桂醛抗辣椒疫霉增效作用研究

引言

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 纳米化肉桂醛的制备

2．2 纳米化肉桂醛的粒径分布

2．3 纳米化肉桂醛的透射电镜

2．4 纳米化肉桂醛的稳定性考察

2．5 纳米化肉桂醛的抑菌活性

3 小结

第五章 全文总结

全文创新点

参考文献

攻读硕士学位期间发表的研究论文

致谢