二化螟对杀虫单代谢抗性的分子机理研究

摘要

二化螟Chlio suppressalis（Walker）是我国重要的水稻害虫，自上世纪末至本世纪初大暴发之后，每年仍稳定发生，对我国水稻的高产稳产带来严重影响。长期以来，二化螟在生产上主要依靠药剂防治，但受水田粮食作物钻蛀性害虫用药选择的限制，生产上经常是个别药剂的持续大量使用，致使二化螟陆续对多种高效治螟杀虫剂产生抗性，使田间药剂防治更为困难。
　　杀虫单是沙蚕毒素类仿生农药，作用机制独特，内吸渗透性好，对水稻螟虫有特效，且环境友好，自问世以来一直是防治水稻螟虫的当家品种。尽管上世纪90年代末在局部地区暴发抗药性，但在广大中西部和北方稻区仍在使用。目前沙蚕毒素类杀虫剂尚无新品种上市，因此研究二化螟对杀虫单抗性的分子机理具有重要意义。
　　害虫抗药性涉及到解毒代谢能力增强、作用靶标敏感度下降和表皮穿透能力下降。昆虫体内与药剂抗性相关的解毒代谢酶主要是:细胞色素P450氧化酶(P450)、酯酶(EST)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。为了找出二化螟对杀虫单抗性相关的解毒代谢酶，本文首先对不同地理种群二化螟作了抗药性监测，克隆验证了二化螟GST基因，合作完成了二化螟主要解毒酶基因的转录组扣基因组分析，同时利用杀虫单诱导实验筛选出可能和杀虫单代谢抗性相关的主要解毒代谢酶基因，比较了不同地理种群的二化螟对杀虫单的抗性及其解毒酶基因在转录水平上的表达差异，为探索二化螟对沙蚕毒素类杀虫剂产生抗性的分子机制提供了理论依据。现将研究结果总结如下:
　　1、不同地理种群二化螟对杀虫单等药剂的抗性监测
　　本研究首先利用初孵幼虫人工饲料药膜法和四龄幼虫点滴法比较测定了南昌二化螟种群和室内敏感种群对杀虫单的抗性。结果显示:人工饲料药膜法和点滴法的结果趋势一致，但是药膜法更加灵敏，测得的抗性更加明显。随后选用药膜法测定了采自我国不同地区的二化螟种群对杀虫单、毒死蜱、氯虫苯甲酰胺和丙溴磷的抗性，发现2012年扬州地区二化螟对杀虫单抗性仍处于敏感水平(RR3.8)，江西南昌、浙江金华、温州、安徽和县等地区的二化螟对杀虫单都处于中抗水平(RR13.2～29.5)。2013年监测7个地区发现，重庆万州和江苏扬州的二化螟对杀虫单均为低水平抗性(RR9.0、7.7)，广西桂林、湖南湘潭、江西南昌、浙江金华和湖北武汉等5个地理种群均为中抗(RR13.5～21.7);不同地理种群对丙溴磷抗性普遍处于中、高抗水平(RR33.3～86.5)，只有重庆万州种群对丙溴磷处于较敏感水平（RR0.9）;重庆万州、湖北武汉和广西桂林的二化螟种群对毒死蜱均处于敏感水平(RR0.9～1.4)，其余地区处于低抗水平(RR3.6～8.8);7个地理种群对氯虫苯甲酰胺普遍较敏感(RR1.0～1.9)，只有浙江金华和江西南昌种群略显抗性，分别为9.4和5.3倍。
　　2、二化螟GST基因的克隆验证及同源性分析
　　谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferases，GSTs）是一个超基因家族，广泛分布于生物体中，是一种重要的解毒酶系。在20多种昆虫中已经发现了超过百余种GST，可分为Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta、Zeta等家族，其中昆虫特异的家族有Delta和Epsilon家族。本研究利用二化螟转录组和基因组数据进行二化螟GST基因的研究，共克隆了26条二化螟谷胱甘肽S-转移酶基因（CsGST）;并通过NCBI的BlastX比对，发现最相近的物种有君主斑蝶（Danaus plexippus）、家蚕（Bombyx mori）、烟实夜蛾（Helicoverpa assulta）、柑橘凤蝶（Papilio xuthus）和烟草天蛾（Manduca sexta），其中24条分别属于Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta、Zeta6个家族，3条属于unclassified家族。利用进化树分析了和其他近缘物种GST的进化发育关系。
　　3、杀虫单对二化螟主要解毒代谢酶的诱导作用
　　本研究以亚致死剂量处理四龄二化螟幼虫，在转录组水平分析了二化螟体内可以被杀虫单诱导的P450、EST和GST基因。先通过半定量RT-PCR分析96条P450基因、45条EST基因和26条GST基因的表达情况，结果发现，杀虫单诱导后P450基因中有13条上调，EST基因有4条上调，GST基因有2条上调。然后通过实时定量PCR，对半定量结果检测到的基因进行定量分析，发现趋势和半定量结果一致，但与对照相比上调显著，且上调达2倍以上的解毒酶基因仅有13个，其中P450基因10条(CYP341、CYP9A52、CYP340、CYP338A1、CYP341B、CYP4G92、CYP321F1、CYP304F13、CYP6AB13、CYP6AB46),EST基因3条(CsEST4、CsEST42、CsESET44)。而2条GST基因只有CsGST1上调了1.4倍。讨论认为，这些上调表达的解毒代谢酶基因可能与杀虫单的解毒代谢有关。
　　4、不同地理种群二化螟抗性基因表达水平测定
　　为探讨二化螟对杀虫单的代谢机制，本研究结合第二章的抗性水平检测结果，挑选了扬州(RR7.7)、南昌(RR13.5)和金华(RR19.0)等对杀虫单抗性不同的地理种群，在转录组水平对比分析了这些种群的P450、 EST和GST基因的表达量差异。先通过半定量RT-PCR技术分析96条P450基因、45条EST基因和26条GST基因的表达情况，结果发现P450基因中有7条在不同地理种群中存在表达差异，EST基因也有7条，GST基因仅有2条。然后通过实时定量PCR技术对半定量实验中筛选到的解毒代谢酶基因进行定量分析，结果利用SPASS软件进行差异显著性分析后发现，在转录水平具有显著差异的P450基因有6条(CYP4L27、CYP304F13、CYP354A、CYP6AB13、CYP9A68、CYP9A69)，EST基因有5条(CsEST14、CsEST25、CsEST37、CsEST43、CsEST44)，GST基因只有1条CsGST7。另外我们发现，金华种群CYP9A68的表达量是扬州低抗种群的9.8倍，南昌种群CsEST37的表达量是扬州种群的9.2倍。讨论认为，南昌和金华抗性种群中，P450和EST解毒代谢能力的提高，在抗药性中发挥了重要作用。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1 二化螟发生概况

1．1 二化螟的分布与危害

1．2 二化螟抗药性的发展

2 昆虫抗药性的研究

2．1 昆虫抗药性的形成

2．2 昆虫抗药性机制

3 二化螟对沙蚕毒素类农药的抗性发展

3．1 沙蚕毒素类杀虫剂

3．2 杀虫单作用机理

3．3 杀虫单抗药性发展

4 本研究的目的和意义

第2章二化螟不同地理种群的抗药性监测

1 材料和方法

1．1 供试昆虫

1．2 试虫饲养

1．3 供试生化制剂和仪器

1．4 人工饲料配置

1．5 毒力测定方法

1．6 统计分析方法

2 结果与分析

2．1 不同生测方法的比较

2．2 2012年二化螟不同地理种群对杀虫单的抗性

2．3 2013年二化螟不同地理种群对杀虫单等4种杀虫剂的抗性

3 讨论

第3章 二化螟GST基因的克隆和分析

1 材料和方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂和仪器设备

1．3 二化螟总RNA的提取

1．4 cDNA的合成

1．5 二化螟GST基因片段的验证

1．6 二化螟GST基因与其他物种的GST基因的进化树分析

2 结果与分析

2．1 二化螟GST基因的克隆及分析

2．2 二化螟GST基因进化树的构建

3 讨论

第4章 杀虫单对二化螟解毒代谢酶的诱导作用

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要生化试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 诱导处理方法

1．5 昆虫总RNA的提取

1．6 RNA完整性检测和浓度确定

1．7 cDNA的合成

1．8 抗性相关解毒代谢酶基因的半定量RT-PCR筛选

1．9 抗性相关解毒代谢酶基因的定量PCR验证

2 结果与分析

2．1 半定量PCR反应循环数的确定

2．2 杀虫单诱导解毒代谢酶基因的半定量结果

2．3 杀虫单诱导解毒代谢酶基因的定量表达分析

3 讨论

第5章 不同地理种群二化螟抗性基因表达水平测定

1 材料和方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂和仪器设备

1．3 主要仪器设备

1．4 昆虫总RNA的提取

1．5 cDNA的合成

1．6 抗性相关解毒代谢酶基因的半定量RT-PCR筛选

1．7 抗性相关解毒代谢酶基因的定量PCR验证

2 结果与分析

2．1 二化螟不同地理种群的解毒代谢酶基因半定量结果

2．2 定量PCR引物特异性、扩增效率及其一致性分析

2．3 二化螟不同地理种群解毒代谢酶基因的表达量分析

3 讨论

全文总结

参考文献

附录

致谢

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