转草地早熟禾PpCBF3基因提高拟南芥抗寒性

摘要

草地早熟禾(Poa Pratensis L.)是温带地区常用的优质冷季型草坪草种，是已知的抗寒能力最强的草坪草种之一。植物体内存在多条低温信号传递和调控途径，其中,DREB1/CBF调控途径被认为是植物抵御低温的主要途径。DREB1/CBF基因是植物响应低温胁迫的转录激活因子，它通过调控下游基因包括冷应答基因(COR)的表达来提高植物的抗寒能力。
　　本研究从抗寒的草地早熟禾中克隆到一个DREB1/CBF类基因—PpCBF3，通过转化模式植物拟南芥，旨在快速研究该基因在抗寒性中的作用，为改良冷敏感多年生草坪草种的抗寒性奠定基础。本实验主要研究结果如下:
　　(1)从低温处理后的草地早熟禾叶片中分离出一个开放阅读框(ORF)全长为732bp，编码243个氨基酸的基因。序列分析表明该基因在AP2 DNA结构域的上游和下游分别具有PKK/RPAGRXKFXETRHP和DSAEL这两段DREB1/CBF转录因子的特征序列。根据系统进化树分析，PpCBF3与多年生黑麦草LpCBF3同源性最高，与其他单子叶植物和拟南芥的DREB1/CBF3基因也有很高的同源性，因此认为PpCBF是一个DREB1/CBF转录因子。
　　(2)瞬时转化拟南芥原生质体实验结果表明，PpCBF3特异地定位于细胞核中，与基因中具有核定位信号(NLS)的结果相符。
　　(3)荧光定量PCR实验和半定量实验表明，PpCBF3基因受低温诱导，低温处理15min时PpCBF3已响应表达，1h表达量最高，24 h后其表达量仍显著高于常温状态。在干旱胁迫和高盐胁迫下，草地早熟禾PpCBF3基因的mRNA相对表达量并无明显改变，因此推测PpCBF3不响应干旱胁迫(20％ PEG-6000)和盐胁迫(150 mM NaCl)。
　　(4)通过农杆菌侵染法转化拟南芥，通过双丙胺膦(Basta)筛选和PCR鉴定，得到12个阳性转基因株系。对其进行冷冻(-20℃)处理，并根据叶片枯黄率的结果筛选出5个稳定的抗性转基因株系，即line3，line6，line9，line11和line12。mRNA相对定量表达分析和western印运分析表明，转基因株系的PpCBF3都能够在常温下稳定表达。
　　(5)在常温下，转基因拟南芥中DREB1/CBF下游基因COR15a，COR6.6/KIN2，COR47和COR78/RD29a和脯氨酸合成的关键酶基因P5CS的相对表达量都显著高于WT植株。而在低温处理后，尽管WT中这些基因的表达量提高，转基因株系中这些基因的表达量仍然显著高于WT。另外，在冰冻处理后，转基因拟南芥叶片相对电导率，Fv/Fm值和叶绿素含量都显著高于WT; DAB染色和NBT染色结果显示，WT拟南芥在低温胁迫下的H2O2和O2·-含量更高。
　　(6)转基因拟南芥普遍出现开花推迟、矮化或生长延缓等特性，这些特性对多年生草坪草种的基因改良有着极大的意义。
　　综上所述，从草地早熟禾中克隆到转录因子PpCBF3，它特异受低温诱导，对干旱胁迫和盐胁迫没有响应。通过转化模式植物拟南芥，初步确定该基因通过对下游基因表达及生理生化的调控，提高植物抗冻性。该研究为培育抗寒草坪草新种质提供重要的基因资源。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 文献综述

1 低温胁迫影响植物生长发育

2 植物冷驯化的生理及分子机制

2．1 植物细胞中响应低温胁迫的分子

2．2 植物细胞在低温胁迫下的适应性调整

2．3 低温信号传递和调控途径

3 DREB1／CBF转录因子

3．1 DREB1／CBF转录因子家族

3．2 DREB1／CBF转录因子的结构

3．3 不同植物中的DREB1／CBF转录因子

4 DREB1／CBF途径分子调控机制

4．1 冷信号的感受

4．2 上游基因对DREB1／CBF类转录因子的调控

4．3 DREB1／CBF自我调控

4．4 DREB1／CBF下游基因的调控与表达

4．5 其他转录因子对CBF信号转导途径的影响

5 超量表达DREB1／CBF基因对转基因植物生长发育的影响

6 本研究的目的和意义

第二章 草地早熟禾PpCSF3 cDNA全长的克隆和基因表达模式分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 PpCBF3基因cDNA全长的克隆

2．2 PpCBF3的序列分析

2．3 亚细胞定位分析

2．4 PpCBF3基因对非生物胁迫的响应

3 讨论

第三章 农杆菌介导的遗传转化及PpCBF3基因功能研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 转基因表达载体的构建

2．2 T1代转基因阳性植株的鉴定

2．3 超量表达PpCBF3对拟南芥抗寒能力的影响

2．4 正常生长条件下培养的转基因株系和野生型的表型差异

3 讨论

3．1 PpCBF3转基因拟南芥激活下游基因的表达，从而提高了自身对极端寒冷胁迫的能力

3．2 超量表达PpCBF3改变拟南芥的表型

第四章 全文结论

参考文献

附录

攻读学位期间论文发表情况

致谢