家蚕抗菌蛋白Attacin 1对球孢白僵菌的抗菌活性及抗菌肽Cecropin A的表达特征

摘要

抗菌肽是宿主在免疫过程中产生的一类重要抗菌复合物。家蚕Attacin1(BmAttacin1)蛋白是抗菌肽中的一种，其开放阅读框(ORF)编码214个氨基酸。我们的前期研究中发现BmAttacin1基因在球孢白僵菌（Beauveria bassiana）感染的家蚕幼虫体内显著上调表达。本文运用生物信息学软件预测其N端1~17号氨基酸为信号肽，成熟蛋白三级结构主要形成反平行β-片层结构；实时荧光定量PCR检测结果进一步证明家蚕幼虫在被球孢白僵菌感染后BmAttacin1基因显著上调表达。以家蚕大造(p50)品种幼虫三龄起蚕cDNA为模板，克隆出BmAttacin1成熟蛋白编码序列，利用原核表达系统成功表达获得BmAttacin1蛋白，抑菌圈实验结果表明BmAttacin1对革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)和球孢白僵菌有明显的抑菌效果，而对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）没有抑菌效果；进一步将BmAttacin1与球孢白僵菌分生孢子孵育，间接免疫荧光检测发现BmAttacin1能与球孢白僵菌分生孢子结合。在家蚕培养细胞（BmN）过表达BmAttacin1基因后，家蚕其它七种抗菌肽基因也都上调表达，其中天蚕素类抗菌肽BmCecropin A基因的表达上调了10倍，BmCecropin B上调了9倍，表明BmAttacin1基因的表达可能对其它抗菌肽基因的表达具有协同增强作用。本结果为深入研究BmAttacin1与球孢白僵菌的相互作用以及BmAttacin1在家蚕抵御球孢白僵菌感染过程中发挥的作用奠定了一定的基础。 家蚕Cecropin A（BmCecropin A）也是抗菌肽的一种，其ORF编码63个氨基酸。课题组前期研究发现BmCecropin A在家蚕体内体外都对球孢白僵菌有明显的抑菌作用，但其发挥作用的具体机制还不清楚。本文根据NCBI登录的BmCecropin A的ORF序列，运用生物信息学软件预测其1~22号氨基酸为信号肽，抗原表位氨基酸序列为AIAVIGQA，结合对BmCecropin A成熟肽结构的分析及同源序列的比对，化学合成法合成BmCecropin A23~63以及51~63两条氨基酸序列，分别偶联KLH和BSA后以此为抗原混合免疫Balb/c小鼠，蛋白质印迹检测结果表明免疫后的小鼠血清对BmCecropin A具有特异性抗原抗体反应；通过细胞融合和杂交瘤细胞株筛选，获得两株阳性杂交瘤细胞。利用杂交瘤细胞株培养基上清对大造品系家蚕血淋巴进行蛋白质印迹检测，结果显示其中一株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能在PVDF膜上与抗原结合产生单一条带，大小约为5kD，即为目的蛋白BmCecropin A，表明该杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体可识别BmCecropin A的线性表位，不依赖于抗原的特定构象。用该株杂交瘤细胞制备单克隆抗体并通过蛋白质印迹检测BmCecropin A在家蚕各组织中的特异性表达情况，结果仅在脂肪体组织中检测到特异性抗体抗原反应。异丙醇沉淀法提取家蚕血淋巴蛋白，蛋白质印迹检测发现感染球孢白僵菌32h的家蚕幼虫血淋巴中抗菌肽CecropinA上调表达。本结果为BmCecropin A的深入研究及论证其在家蚕抵御球孢白僵菌侵染过程中发挥的重要作用奠定了基础。

目录

声明

英文缩写说明

第一章 引 言

1.1球孢白僵菌和家蚕

1.2抗菌肽

1.2.1家蚕抗菌肽

1.2.2抗菌肽的分类

1.2.3抗菌肽的功能

1.3抗菌肽的作用机制

1.4研究目的及意义

1.5主要研究内容

第二章家蚕抗菌蛋白Attacin 1对球孢白僵菌的抗菌活性

2.1材料与试剂

2.1.1实验材料

2.1.2仪器设备

2.1.3试剂

2.2实验方法

2.2.1BmAttacin 1生物信息学分析

2. 2.2 家蚕感染球孢白僵菌后 BmAttacin 1基因的表达模式分析

2.2.3BmAttacin 1成熟蛋白编码序列的克隆

2.2.4BmAttacin 1原核表达载体的构建

2.2.5 BmAttacin 1的诱导表达及鉴定

2.2.6BmAttacin 1蛋白大量表达及纯化

2.2.7BmAttacin 1蛋白透析复性、浓缩及鉴定

2.2.8BmAttacin 1抑菌实验

2. 2.9 BmAttacin 1与球孢白僵菌分生孢子的相互作用

2. 2.10 BmAttacin 1过表达载体的构建

2. 2.11 BmAttacin 1 过表达及实时荧光定量PCR分析

2.3结果与分析

2.3.1 BmAttacin1生物信息学分析

2.3.2家蚕幼虫感染球孢白僵菌后BmAttacin 1基因的表达变化

2.3.3 BmAttacin 1成熟蛋白的表达、纯化及鉴定

2.3.4 BmAttacin 1的抑菌实验

2.3.5 BmAttacin 1与球孢白僵菌分生孢子的相互作用

2.3.6 BmAttacin 1的过表达及实时荧光定量PCR分析

2.4讨论

第三章家蚕抗菌肽Cecropin A的单克隆抗体制备及表达特征

3.1材料与试剂

3.1.1材料

3.1.2仪器设备

3.1.3试剂

3.2实验方法

3.2.1BmCecropin A信号肽预测

3.2.2 BmCecropin A成熟肽同源性分析

3.2.3 BmCecropin A成熟肽抗原性分析及抗原多肽设计

3.2.4 BmCecropin A抗原多肽合成、免疫以及小鼠血清效价检测

3.2.5小鼠血清中抗体对BmCecropin A特异性识别检测

3.2.6 Balb/c小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选

3.2.7阳性杂交瘤细胞株培养基中抗体对BmCecropin A特异性识别检测

3.2.8单克隆抗体的大量制备及BmCecropin A在各组织中的差异性表达

3.2.9家蚕感染球孢白僵菌后Cecropin A的上调表达模式

3.3结果与分析

3.3.1 BmCecropin A信号肽预测

3.3.2 BmCecropin A成熟肽同源性分析

3.3.3 BmCecropin A成熟肽抗原性分析及抗原多肽设计

3.3.4 BmCecropin A免疫Balb/c小鼠以及小鼠血清效价检测

3.3.5小鼠血清中抗体对BmCecropin A特异性识别检测

3.3.6阳性杂交瘤细胞株培养基上清对BmCecropin A特异性识别检测

3.3.7单克隆抗体的制备及BmCecropin A的组织差异性表达

3.3.8家蚕感染球孢白僵菌后Cecropin A的表达模式

3.4讨论

第四章 全文讨论和结论

参考文献

攻读硕士期间的发表的学术论文

致谢