枯草芽孢杆菌芽孢表面展示人血清白蛋白及芽孢的蛋白质组学分析

摘要

人血清白蛋白(human serum albumin,HAS)是血液中最重要的载体蛋白和血浆蛋白成份,具有非常重要的生理功能。在临床医学实践中,HAS被广泛的用来治疗低血容量,慢性肾炎、肝炎和晚期恶性肿瘤等各种重症病人。目前临床上使用的HAS主要是靠收集人的血液通过分级过滤获得,但是人血浆来源有限,价格昂贵,并且来源复杂,容易导致血源性污染,如肝炎病毒,艾滋病毒等。
　　 枯草芽孢杆菌是一种非致病性的革兰氏阳性菌,在营养缺乏或其它胁迫的条件下能形成具有抗逆性的休眠体——芽孢。由于芽孢具有独特的抗逆性,在极端的温度、辐射和毒性化学物质的环境下也能长期存活。因此,芽孢成为在极端环境中运载外源蛋白或具有活性的生物大分子的有效载体。本研究的目的是通过芽孢表面展示技术将}tSA展示在芽孢表面,构建具有营养功能的表面展示有HAS的重组芽孢。本研究的主要内容和结果如下:
　　 (1)提取人体组织的总RNA,通过反转录和PCR扩增出人血清白蛋白基因has的编码序列,并进行测序和数据库比对鉴定。
　　 (2)将has克隆到质粒pJS700上,使has与芽孢衣壳蛋白基因cotC融合,构建融合表达CotC-HSA的整合型重组质粒pJS700-HSA。
　　 (3)用质粒pJS700-HSA转化枯草芽孢杆菌感受态细胞,筛选得到重组菌株并诱导该菌株产生芽孢,用Westernblot和免疫荧光检测HSA成功的展示在芽孢表面。
　　 (4)用表面展示HSA的重组芽孢口服接种小鼠,持续灌胃30天,摘眼球取血分析口服重组芽孢对小鼠血清白蛋白含量的影响。结果表明口服芽孢不会给小鼠胃肠道带来不适,并且口服大剂量重组芽孢可以有效增加小鼠血清中白蛋白的含量。
　　 (5)用二维电泳和质谱鉴定技术对枯草芽孢杆菌芽孢的蛋白质表达谱进行分析。二维电泳后总共获得158个蛋白点,用质谱成功鉴定出71个蛋白,之后对鉴定的蛋白进行功能分类和亲水性分析。
　　 (6)对野生型和转基因枯草芽孢杆菌的芽孢蛋白进行比较蛋白质组学分析,研究外源基因的插入对菌株蛋白表达的影响。二维电泳后通过软件分析二维图谱,总共找出32个差异蛋白,用质谱成功鉴定出21个差异蛋白,对鉴定的蛋白进行功能分类和KEGGpathway分析,并用荧光定量PCR进行验证。结果表明外源基因的插入对宿主菌的蛋白表达产生了影响。