可食用资源家蚕的核型多角体病毒抗性基因的高通量分子标记筛选、定位及相关基因功能

摘要

家蚕是一种重要的经济和模式昆虫，也是一种重要的可食用资源。随着人们生活水平的提高，家蚕这种优质蛋白质脂肪资源逐渐得到重视，开始出现规模化的利用家蚕或蚕蛹作原料的功能食品生产，这也对蚕业生产提出了新的要求。在蚕业生产中经常遇到一种病毒病的危害，即家蚕核型多角体病毒病(Bombyx morinucleopolyhedrovirus，BmNPV)，每年能对蚕业生产造成巨大危害，约占整个蚕病损失60％以上，在我国夏秋蚕期以及印度等养蚕国家尤为严重，该蚕病目前在世界上还停留在预防阶段。最新的一些研究表明这种杆状病毒能够进入到哺乳动物细胞，这对家蚕作为可食用资源的开发和利用带来一定潜在的威胁。所以无论在食用、生产还是安全方面考虑，对于家蚕核型多角体病毒病抗病基因的寻找和抗性机制的阐明都是一项重要的工作。本课题组从340个家蚕品种资源中鉴定出一种抗性资源，通过组配家蚕遗传模型，从DNA、RNA和蛋白质水平进行过抗性基因筛选工作，取得一些进展，但到目前为止，没有获得抗性基因。
　　本研究通过第二代高通量测序技术与群组分离分析相结合的方法对BmNPV抗性基因分子标记进行了筛选和连锁分析，最终将抗性基因初步定位，并对抗性基因候选区域进行了分析获得了候选抗性基因，并对一个可能参与抗病毒过程的基因V-ATPase进行了进一步分析。
　　本研究主要结果如下:
　　1.通过第二代高通量测序技术对BmNPV抗性品系NB和感性品系306亲本进行简化基因组测序，一共获得62185个标记，对这62185个标记根据亲本基因型关系进行多态性分析，最终获得5441个多态性标记，其中单核苷酸多态性标记(SNP)4765个，酶切位点单核苷酸多态性标记(EPSNP)355个和插入缺失突变标记(INDEL)311个。
　　2.对于BmNPV抗性家蚕品系NB和感性品系306所具有的5441个多态性标记进行基因结构分析，发现有327个多态性标记存在于基因编码区内，其中有138个为氨基酸水平的突变。通过COG、GO和KEGG数据库对这些突变蛋白进行注释发现，感性亲本306涉及家蚕免疫的蛋白，如丝氨酸蛋白酶(BGIBMGA006406)，丝氨酸蛋白酶抑制剂(BGIBMGA013848)，胰凝乳蛋白酶(BGIBMGA008242)和一种与人类HSP40/DnaJ同源的热休克蛋白家族成员(BGIBMGA013135)，以及两种与DNA复制修复相关蛋白(BGIBMGA001493，BGIBMGA003650)发生了突变，提示306家蚕品系对于各种病原微生物与环境的敏感性很可能与其免疫系统的先天缺失有关。
　　3.对NB和306回交群体BC1按抗感性进行分组，各取40只提取DNA进行混池测序分析，并对筛选到的多态性标记进行连锁分析，最终发现了4个与抗性性状紧密连锁的标记，并将抗性基因定位在了家蚕第23号染色体一段0.67 Mb的区域。对于抗性基因紧密连锁区域的分析发现含有22个预测基因，对这22个基因进行RT-PCR检测发现只有6个能在家蚕中肠表达，克隆测序结果表明其中有2个酯酶基因发生突变，功能预测表明很有可能为BmNPV抗性基因。
　　4.对于经口接种BmNPV后抗性和感性家蚕中肠的V-ATPase酶活分析表明，抗性家蚕NB和BC8添毒后24小时中肠内膜系统的V-ATPase酶活出现升高，体外过表达及病毒抑制试验表明V-ATPase确实参与了家蚕抗BmNPV的过程。

目录

声明

摘要

第一章 可食用资源家蚕的抗性遗传研究进展

1．1 可食用昆虫资源

1．1．1 可食用昆虫资源家蚕的营养价值

1．1．2 可食用昆虫资源家蚕的保健功效

1．1．3 家蚕功能食品的开发

1．1．4 家蚕核型多角体病毒及其对于家蚕食品开发的危害

1．2 杆状病毒概况

1．2．1 杆状病毒的形态结构

1．2．2 杆状病毒的生活史

1．3 昆虫的病毒免疫研究

1．3．1 免疫信号传导

1．3．2 抗菌肽

1．3．3 酚氧化酶原级联依赖的黑化和包裹作用

1．3．4 细胞凋亡机制

1．3．5 其他免疫方式

1．4 家蚕抗家蚕核型多角体病毒的研究进展

1．4．1 影响家蚕对杆状病毒感受性的因素

1．4．2 已经分离和鉴定的抗BmNPV物质

1．4．3 抗BmNPV家蚕资源的发现和鉴定

1．4．4 家蚕抗BmNPV的遗传规律研究

1．4．5 家蚕抗BmNPV的分子标记研究

1．4．6 RNA水平对家蚕抗BmNPV的研究

1．4．7 蛋白质水平对家蚕抗BmNPV的研究

1．4．8 其他抗BmNPV相关分子

1．5 空泡膜ATP合成酶

1．5．1 V-ATPase概况

1．5．2 V-ATPase与家蚕抗BmNPV的联系

1．6 家蚕抗病毒的研究方法

1．6．1 常用分子标记的种类和特点

1．6．2 单核苷酸多态性标记与简化基因组测序

1．6．3 群体分离分析法

1．7 研究意义和目的

1．8 研究主要内容、目标及技术路线

1．8．1 研究内容

1．8．2 研究目标

1．8．3 技术路线

第二章 家蚕抗BmNPV遗传材料的准备

2．1 材料与方法

2．1．1 BmNPV多角体病毒的繁殖与纯化

2．1．2 家蚕品种和遗传材料组配方式

2．1．3 家蚕接种病毒及取材

2．1．4 用于第二代高通量测序的家蚕DNA提取

2．1．5 DNA质量检测

2．2 结果与分析

2．2．1 不同家蚕群体在接种BmNPV后的发病情况

2．2．2 家蚕基因组的提取

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 家蚕抗BmNPV分子标记的高通量筛选和连锁分析

3．1 材料与方法

3．1．1 构建SLAF测序文库

3．1．2 SLAF测序

3．1．3 家蚕亲本基因组多态性分析

3．1．4 多态性SLAF标记的连锁分析

3．2 结果与分析

3．2．1 测序结果统计

3．2．2 多态性SLAF分析

3．2．3 家蚕抗性亲本NB与感性亲本306的蛋白突变分析

3．2．4 多态性SLAF标记的连锁分析

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 家蚕抗BmNPV候选基因的初步验证

4．1 试剂和操作

4．1．1 常用试剂

4．1．2 常规操作

4．2 材料与方法

4．2．1 家蚕品种

4．2．2 抗性候选基因的分析

4．2．3 家蚕中肠cDNA的合成

4．2．4 候选基因在中肠的表达分析

4．2．5 候选基因的克隆和测序

4．2．6 测序结果整理和分析

4．3 结果与分析

4．3．1 候选基因功能注释

4．3．2 候选基因中肠表达分析

4．3．3 候选基因在中肠的RT-PCR分析

4．3．4 候选基因的测序分析

4．3．5 候选基因的突变分析

4．3．6 候选基因在BC8中的分析

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 家蚕抗BmNPV相关基因的功能分析

5．1 试剂和操作

5．1．1 常用试剂

5．1．2 常规操作

5．2 材料与方法

5．2．1 昆虫、载体和细胞系

5．2．2 BmNPV的繁殖、纯化及计数

5．2．3 家蚕添毒处理及取材

5．2．4 家蚕中肠粗提物和中肠质膜蛋白的提取

5．2．5 ATPase酶活测定

5．2．6 过表达V-ATPase对BmNPV增殖的影响

5．2．7 数据的统计分析

5．3 结果与分析

5．3．1 家蚕中肠的V-ATPase酶活检测

5．3．2 体外过表达对BmNPV增殖的影响

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 结论与展望

6．1 研究结论

6．1．1 BmNPV抗性基因的分子标记筛选

6．1．2 BmNPV抗性亲本和感性亲本的多态性分析

6．1．3 BmNPV抗性基因的初步定位

6．1．4 BmNPV抗性基因的验证分析

6．1．5 BmNPV抗性相关基因的分析

6．2 展望

参考文献

论文主要创新点

在研期间发表的研究论文和参加的课题

致谢

附录