人脐带MSC来源exosome活化自噬对HK-2细胞顺铂损伤的预防和机制研究

摘要

目的：
　　前期的研究结果表明，人脐带间充质干细胞来源的外泌体（exosome secreted by human umbilical cord mesenchymal stem cells，hucMSC-ex）能有效的预防和减缓顺铂对大鼠肾脏的损伤，但其作用机制尚不明确。本研究构建了hucMSC-ex体外预防顺铂对人肾小管上皮细胞（HK-2）的损伤模型，揭示了hucMSC-ex预防顺铂引起HK-2细胞的分子机制，为临床上hucMSC-ex预防顺铂诱导肾毒性提供了实验依据。
　　方法：
　　常规培养的HK-2细胞为control组；cis组为16μmol/L顺铂处理16h；ex+cis组为用200μg/ml的hucMSC-ex与HK-2细胞孵育24h后，加入16μmol/L的顺铂继续培养16h；3-MA+ex+cis组为100μmol/L的3-MA和200μg/ml的hucMSC-ex同时预孵育HK-2细胞24h后，加入16μmol/L的顺铂继续处理16h。透射电子显微镜观察hucMSC-ex的形态，成像流式细胞仪和Western blot检测hucMSC-ex表面标记CD9、CD63的表达。过表达和敲减功能研究用于探索14-3-3ζ在hucMSC-ex预防顺铂肾毒性中的作用。TUNEL实验和凋亡双染流式分析检测HK-2细胞的凋亡。免疫荧光分析了核增殖抗原（PCNA）的表达。超高分辨率荧光显微镜观察细胞自噬小体形成的数量和形态大小。Western blot技术检测了14-3-3ζ、LC3B、P62、PCNA、Bax等蛋白的表达水平。
　　结果：
　　人脐带间充质干细胞来源的外泌体（hucMSC-ex）呈圆形或椭圆形，表面表达特异性分子CD9、CD63。HucMSC-ex与HK-2细胞孵育后，可通过减少细胞凋亡数量、增加PCNA的表达来预防顺铂诱导的细胞损伤。在此过程中，自噬相关指标LC3BⅡ/LC3BⅠ比值增加，自噬底物P62表达水平下降，提示自噬活化。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）则可逆转hucMSC-ex的顺铂损伤保护作用。HucMSC-ex预处理后，14-3-3ζ表达水平增加。敲减hucMSC-ex中的14-3-3ζ蛋白后，14-3-3ζ表达水平下调，hucMSC-ex诱导细胞自噬的作用减弱，同时预防顺铂的损伤作用也弱化。过表达HK-2细胞中的14-3-3ζ可以增强细胞自噬水平而缓解细胞的顺铂损害。敲减HK-2细胞中的14-3-3ζ可以下调细胞自噬水平，同时增加了顺铂的细胞损伤。而通过hucMSC-ex携带14-3-3ζ回补了14-3-3ζ表达后，被增强的顺铂损伤又得以逆转。
　　结论：
　　HucMSC-ex携带的14-3-3ζ蛋白可以预防顺铂对人肾小管上皮细胞（HK-2）的损伤作用。其作用机制可能是通过上调HK-2细胞的自噬水平而保护细胞免受顺铂的损伤。这一研究为hucMSC-ex预防顺铂诱导的肾损伤作用提供了新的思路和方案。

目录

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图表目录

英文缩写中文注释表

第一章 绪论

1.1 肾毒性

1.2 外泌体（exosome）

1.3 细胞自噬

1.4 14-3-3蛋白及功能

第二章 研究目的、方法、实验设计方案和研究意义

2.1 研究目的

2.2 研究方法

2.3 实验设计方案

2.4 研究意义

第三章 HucMSC-ex预处理减缓顺铂对HK-2细胞的损伤

3.1 材料与仪器

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 HucMSC-ex 通过增强自噬发挥预防顺铂对HK-2细胞的损伤作用

4.1 材料与仪器

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

第五章 HucMSC-ex携带14-3-3ζ 参与自噬的调节预防顺铂肾毒性

5.1 材料与仪器

5.2 方法

5.3 结果

5.4 讨论

第六章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的科研成果参加的学术会议及获奖情况

一、科研成果

二、参加会议

三、获奖情况