没食子酸抗线粒体氧化应激损伤作用及其机制研究

摘要

目的：缺血再灌注损伤（I/R）是存在于临床上多种疾病发生、治疗以及预后的一种病理反应，包括脑中风，器官移植，心脏搭桥，溶栓等，大量研究证明线粒体氧化应激损伤在各种病理过程中发挥重要作用，有效的抑制线粒体氧化应激是抑制缺血再灌注损伤的一个重要方式。没食子酸（GA）作为一种多羟基酸，存在于多种天然植物中，研究发现，GA具有抗氧化功效以及潜在的线粒体保护作用，但其分子机制尚不明确。为进一步研究GA是否能够对抗缺血再灌注导致的线粒体氧化应激损伤，本研究将从多方面探讨GA对抗氧化应激的功效及其机制。 方法：为研究GA对线粒体氧化应激损伤的相关作用，在第一章实验中本组分别从离体和在体水平进行了系统研究。离体实验部分，采用血管紧张素II（AngⅡ）成功构建人脐静脉内皮细胞（HUVECs）线粒体氧化应激损伤模型，并在分别预作用不同浓度GA（0.1, 1, 10μmol/L）后，采用MTT法检测细胞存活率，MitoSOX Red荧光探针法检测线粒体ROS水平，JC-1 荧光探针检测线粒体膜电位变化，MDA 检测脂质过氧化水平；在体实验部分，将实验动物随机分为假手术组（Sham）、模型组（I/R）、I/R+GA 50 mg/kg组、I/R+GA 100 mg/kg 组，采用小鼠肝脏缺血再灌注损伤成功建立在体线粒体氧化应激损伤模型，采用比色法检测各组血清样本中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平，H&E 染色检测肝脏组织细胞病理变化程度，免疫组化法检测细胞凋亡水平，MitoSOX Red探针法检测离体肝脏线粒体ROS水平，Western blotting法检测肝线粒体细胞色素C（Cyto C）释放水平。通过以上实验系统验证GA对线粒体氧化应激损伤的保护作用。 为进一步确认GA抑制线粒体氧化应激损伤的分子机制，在第二章中本研究组分别从离体和在体水平进行了系统研究。离体实验部分，采用AngⅡ构建HUVECs线粒体氧化应激损伤模型，采用RT-PCR、Western blotting和免疫荧光染色法对线粒体内NOX 4表达水平及其活化重要调节蛋白Poldip 2表达和分布变化情况进行检测，免疫共沉淀检测线粒体内Poldip 2、NOX 4、CypD蛋白的结合水平，Western blotting法确认了Poldip 2蛋白在线粒体氧化应激损伤中的剪切变化及其调控因素，siRNA法确认了Poldip 2、NOX 4、CypD蛋白的结合过程中的相互作用关系；在体水平上采用小鼠肝脏缺血再灌注损伤构建在体线粒体氧化应激损伤，Western blotting法确认了Poldip 2蛋白在线粒体氧化应激损伤中的剪切变化，免疫组化法检测离体肝脏线粒体的Cyto C的释放，并预作用环孢素A（CsA）特异性抑制MPTP开放后，进一步验证了Poldip 2与NOX 4结合与MPTP的相关性。通过以上实验首次提出CypD-Poldip 2-NOX 4轴调控线粒体氧化应激损伤新机制。 因本研究组前期研究已证明 GA 抑制线粒体功能障碍与调节 ERK 磷酸化水平，影响CypD 表达有关，结合前两个部分的研究结果，为进一步证明 GA 对抗线粒体氧化应激损伤的分子机制，明确其线粒体保护作用与CypD-Poldip 2-NOX 4轴的相关性，在第三部分中，本组采用Western blotting和免疫共沉淀法对ERK磷酸化影响CypD表达情况，及其在使用ERK磷酸化阻断工具药（U0126）后对GA影响Poldip 2蛋白剪切水平，Poldip 2与NOX 4结合水平进行了检测，此外采用MitoSOX Red和 Calcein-CoCl2荧光探针对线粒体ROS水平以及线粒体膜通透性进行了验证。通过以上实验明确GA抑制线粒体氧化应激损伤的分子机制。 结果：在第一章实验中，本研究组首次发现，GA可以有效对抗AngⅡ诱导的HUVECs线粒体氧化应激损伤，与模型组相比，GA显著提高了细胞存活率，减少了线粒体ROS的生成，降低了细胞的凋亡水平，保护了线粒体功能；同时GA对小鼠肝脏缺血再灌注损伤也具有显著的保护作用，与模型组相比，GA 100 mg/kg组的肝损伤程度，ALT和AST水平，线粒体ROS及其Cyto C释放水平显著减少，由以上结果我们初步得出GA对线粒体氧化应激的抑制作用。 在第二章实验中，本研究组首次发现线粒体氧化应激损伤状态下Poldip 2与NOX 4表达与分布并未发生显著变化，但其结合水平较正常对照组有显著性增加，进一步采用siRNA以及CypD抑制剂后，本组首次发现Poldip 2与NOX 4结合与CypD密切相关，有趣的是线粒体氧化应激损伤状态下线粒体内Poldip 2蛋白发生了显著性剪切，该变化和可能是其与CypD结合增加的关键因素之一，进一步采用钙离子以及线粒体自噬调节剂后，本组首次发现Poldip 2蛋白剪切变化与细胞内钙稳态失调密切相关，该结果则从另一个角度解释了线粒体氧化应激损伤与线粒体内钙紊乱的实验现象，为探索线粒体氧化应激损伤新机制指明了方向。 在第三章实验中，本研究组首次发现与GA对Ang II诱导的线粒体氧化应激损伤所致的Poldip 2蛋白剪切以及Poldip 2与NOX 4结合具有显著逆转作用，因第二部分结果指出CypD在Poldip 2与NOX 4结合过程中发挥重要作用，而本组前期实验证明ERK-CypD轴是调控 GA 线粒体保护作用的关键通路，值得关注的是在使用 ERK 磷酸化抑制剂 U0126后，GA对HUVEC线粒体Poldip 2-NOX 4结合，以上结果证明GA是通过ERK-CypD-Poldip 2轴发挥了对线粒体氧化应激损伤的调控作用。 结论：GA通过ERK-CypD-Poldip 2轴有效抑制了线粒体内NOX 4的活化，从而对由此产生的线粒体氧化应激损伤发挥了显著的调控作用，该结果进一步补充了本组之前的发现，对今后I/R条件下线粒体氧化应激损伤分子机制及其逆转药物研发都将具有重要意义。

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