C/EB Pα对高氧暴露后AECⅡ分泌肺泡表面活性蛋白和细胞增殖及凋亡的影响

摘要

目的 支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia ,BPD）是早产儿常见的慢性肺部疾病，BPD的发生与机械通气及长期吸入高浓度氧密切相关。CCAAT增强子结合蛋白α（CCAAT enhancer binding proteinα, C/EBPα）在肺发育及成熟等过程中作为关键转录因子发挥重要作用。本研究首先利用早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（Alveolar typeⅡEpithelial Cell，AECⅡ），探讨高氧暴露对C/EBPα、肺泡表面活性蛋白 A（SP-A）、SP-B、SP-C、SP-D 表达及细胞增殖的影响；同时利用人AECⅡ细胞株，研究过表达C/EBPα对高氧暴露后AECⅡ增殖、凋亡及SP-C的影响，明确C/EBPα在高氧肺损伤中的作用。 方法 SD雌雄大鼠交配，雌鼠孕20 d-21 d时腹腔注射麻醉药后，剖宫取出胎鼠，分离纯化AEC Ⅱ，进行原代培养。利用95% O2构建高氧损伤AECⅡ细胞模型作为高氧组后续实验。将细胞随机分为空气对照组和高氧组。两组细胞分别在培养的24 h、48 h及72 h进行收集。使用倒置相差显微镜观察各组细胞的形态变化，实时荧光定量 PCR(Q-PCR)及 Western blot 法分别检测 AECⅡ细胞中C/EBPα、SP-A、SP-B、SP-C 及 SP-D mRNA及蛋白表达，采用 Cell Counting Kit-8(CCK-8 ）检测 AECⅡ细胞增殖。利用人 AECⅡ细胞株，采用Lipofectamine2000脂质体介导法对AECⅡ细胞进行pcDNA3.1(+)-C/EBPα质粒及pcDNA3.1(+)-空质粒瞬时转染，将细胞随机分为空气组、空气组+pcDNA3.1(+)-C/EBPα质粒组、空气组+pcDNA3.1(+)-空质粒组、高氧组、高氧+pcDNA3.1(+)-C/EBPα 质粒组、高氧+ pcDNA3.1(+)-空质粒组，采用 Q-PCR 及Western blot检测C/EBPα和SP-C mRNA及蛋白表达，CCK-8检测各组细胞增殖， PI 染色法流式细胞仪检测细胞周期分布， Anne xin V/PI 双染流式细胞仪检测AECⅡ细胞凋亡。 结果 （1）空气组AEC Ⅱ细胞随着培养时间的延长，细胞生长状态良好，形态基本正常，未见明显漂浮的死细胞，C/EBPα表达水平逐渐降低，SP-A、SP-B、SP-C、SP-D表达水平及AEC Ⅱ细胞增殖情况逐渐升高；而高氧组AEC Ⅱ细胞形态发生改变，逐渐变为不规则性状，且漂浮的死细胞逐渐增多，C/EBPα、SP-A、SP-B、SP-C、SP-D表达水平及增殖情况在培养48 h达到高峰；且在48 h时，高氧组AECⅡ细胞中C/EBPα、SP-A、SP-B、SP-C、SP-D表达水平及增殖情况明显高于空气组。高氧组AECⅡ细胞C/E BPα表达情况与肺泡表面活性蛋白及AECⅡ增殖情况呈正相关。 （ 2 ） 待 AEC Ⅱ 细 胞 培 养 至 融 合 率 达 到 50% 以 上 后 进 行pcDNA3.1(+)-C/EBPα转染，转染后再次培养48 h，转染组C/EBPα mRNA及蛋白表达水平表达较其它组显著升高（P<0.05）。 （3）与空气组相比，高氧组和高氧+pcDNA3.1(+)-空质粒组细胞增殖、SP-C mRNA及蛋白表达水平显著降低（P<0.05），细胞周期G1期细胞比例增加，S期和G2期细胞明显下降，细胞凋亡率增加（P<0.05）。高氧+pcDNA3.1(+)-C/EBPα组细胞增殖、SP-C mRNA及蛋白表达水平较高氧组、高氧+pcDNA3.1(+)-空质粒组显著升高，细胞周期G1期细胞比例降低，S期和G2期细胞增加，细胞凋亡率降低（P<0.05）。与空气组和空气组+ pcDNA3.1(+)-空质粒组相比，在空气组+pcDNA3.1(+)-C/EBPα质粒组的AECⅡ细胞增殖、凋亡和SP-C表达没有显著的差异。 结论 （1）短期暴露于高氧状态下，C/EBPα可使肺泡表面活性蛋白分泌增加，参与机体的保护性调节作用，但随高氧暴露时间的延长，将丧失代偿保护作用。 （2）C/EBPα过表达可促进高氧暴露后AECⅡ细胞SP-C表达，促进增殖，抑制凋亡，且使S期和G2期细胞明显增加，提示给予过表达C/EBPα可能逆转高氧细胞损伤过程，起到保护作用。

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