血清外泌体miRNA作为肾透明细胞癌新型分子标志物的临床研究

摘要

研究背景：肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是常见的成人泌尿系统恶性肿瘤。最新的流行病学资料显示，RCC发病率约占所有恶性肿瘤的3.8％，死亡率则高达24％，且其发病率以2％至4％的幅度逐年上升。肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma， ccRCC）是RCC最常见和最具侵袭性的一种病理类型，占所有RCC病例的80～90％。ccRCC 的发病机制尚不清楚，约 30％的患者在就诊时即已发展至肿瘤晚期并多数伴有癌细胞转移，导致预后不良。由于 ccRCC 抵抗化疗和放疗，目前手术切除仍是治愈ccRCC的主要手段。临床数据表明，早期ccRCC患者经手术切除后5年生存率高达75％，因此实现 ccRCC 的早期诊断具有极大的临床意义。然而，目前尚无具有早期诊断价值的非侵入性血清学指标。因此，寻找 ccRCC 的无创性早期标志物以实现早期诊断、早期治疗迫在眉睫。 外泌体是不同类型的细胞在正常和病理条件下主动分泌的30-150 nm囊泡，且在循环体液中能够稳定存在。外泌体通过传递生物活性分子（包括信号肽，脂质和核酸）在细胞间通讯中发挥关键作用，特别是通过携带微小核糖核酸（microRNA，miRNA）参与疾病的进展。miRNA是长度为19-24个核苷酸的小非编码RNA，通过转录后调节机制抑制靶基因表达或促使靶基因降解。miRNAs 与多种病理活动尤其是肿瘤密切相关。最新研究发现，ccRCC患者尿液中的一些外泌体miRNAs显著升高，表明其作为ccRCC无创性尿液诊断生物标志物的潜能。然而，ccRCC 患者血清外泌体 miRNAs 的表达及其临床意义鲜有报道。 目的：通过分析ccRCC患者血清外泌体miRNAs水平变化，筛选出ccRCC患者中稳定上调的miRNAs，评价其对ccRCC诊断价值尤其是早期诊断价值。 方法：选取126例未经任何治疗的ccRCC患者的血清外泌体作为研究标本，同时收集124例年龄、性别相匹配的正常人的血清外泌体作为对照。首先应用纳米颗粒跟踪分析技术（nanoparticle tracking analysis，NTA）和蛋白免疫印迹技术（western blotting，WB）分别对外泌体的大小和特征蛋白进行检测和鉴定。其次运用低密度芯片技术（TaqMan low density array，TLDA）对两份分别来自20例ccRCC患者和20例正常对照组成的混合血清样本中的768种miRNA的表达量进行测定，初筛与正常人相比在ccRCC样本中表达明显升高的miRNAs。然后运用实时荧光定量PCR技术（quantitive realtime PCR， qRT-PCR）对初筛的miRNAs在复筛组（27例ccRCC和26例正常血清）进行个体验证，筛选出在患者样本中显著升高的miRNAs。进一步运用qRT-PCR技术在验证组（72例ccRCC和72例正常人）进行验证，以获得在ccRCC中稳定升高的一组miRNAs。另外，在测试组中（从另一个医院收集的病例样本组成）包括27例ccRCC和26例正常对照，对筛选出的miRNAs进行再验证。此外又在40例ccRCC患者术后样本中对筛选出的miRNAs进行检测。最后通过ROC曲线、Risk score分析和Logistic回归分析评价miRNAs及miRNA组合的临床诊断价值。 结果：NTA结果显示，外泌体直径在100 nm左右，与报道一致。WB结果发现，在提取的外泌体中检测到特异蛋白标志物 CD63 和 CD9 的表达。低密度芯片结果显示， ccRCC 患者血清外泌体中miRNA的表达谱与正常对照有显著差异，与正常对照相比， 23种miRNA在ccRCC中表达明显上调（变化倍数>50），从中选取6种循环阈值（cycle threshold，Ct）<30的miRNA（包括miR-28-3p、miR-200a、miR-1826、miR-103、miR-1249和miR-640）进一步分析。qRT-PCR技术在复筛组中对6种miRNA进行个体验证，结果表明，这 6 种 miRNA 在 ccRCC 中的表达水平均显著高于正常对照 （变化倍数为2.90～11.43倍，P<0.05）。在验证组和测试组进一步验证发现，6种miRNA在ccRCC中均显著且稳定升高（变化倍数分别为1.71～3.44倍，P<0.05；2.17～8.24倍，P<0.05）。早期ccRCC中6种miRNA的表达水平也均显著高于正常对照。另外对其中40例患者术前、术后样本进行比较，结果显示，6种miRNA的表达水平在患者术后均显著降低。ROC曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）分析显示，6种miRNA在复筛组、验证组、测试组中的AUC范围分别是0.751～0.893、0.620～0.808、0.744～0.920。其中miR-1826在三组的AUC最大，分别是0.893（95％CI=0.807～0.979），0.808（95％CI=0.738～0.879），0.896（95％CI=0.813～0.979）。根据Risk score分析对6种miRNA进行各种组合比较发现，6-miRNA组合的AUC具有较高的诊断准确性，在复筛组、验证组和测试组中分别是0.751（95％CI=0.619～0.884）、0.804（95％CI=0.729～0.878）、0.887（95％CI=0.791～0.984），优于其他miRNA组合。根据选定的最佳cut off值， 6-miRNA组合在复筛组、验证组和测试组中的阴性预测值（negative predictive value， NPV）和阳性预测值（positive predictive value，PPV）分别为73％和73％、72%和75％、92％和92％。此外，6-miRNA组合早期诊断的AUC为0.832（95％CI=0.774～0.889），根据选定的cut off值，6-miRNA组合对ccRCC早期诊断的NPV和PPV分别是77％和73％。逻辑回归分析显示，6种miRNA及6-miRNA组合的OR值均具有统计学意义。 结论：ccRCC患者血清miRNA表达谱与正常对照有明显差异。6种miRNA（miR-28-3p、miR-200a、miR-1826、miR-103、miR-1249 和 miR-640）在 ccRCC 患者术前样本中的含量显著高于正常对照，并于 ccRCC 的早期阶段即已表现出明显的上升趋势，且在患者术后显著下降。6-miRNA组合对ccRCC早期诊断、手术效果评估方面具有较高的准确性，有望成为ccRCC潜在的液体活检指标。

目录

第一个书签之前