HucMSC来源的外泌体转运miR-373和Let-7b缓解肝纤维化

摘要

目的：肝纤维化是肝硬化和肝癌前期必经的病理过程，其特征为肝星状细胞（hepatic stellate call, HSC）活化导致细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度沉积。前期研究发现人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell, hucMSC）来源的外泌体（hucMSC derived exosome, hucMSC-ex）可修复小鼠肝纤维化，但具体的机制尚不明确。microRNA（miRNA）是非编码单链小 RNA，参与基因的转录后调控，在肝纤维化进程中发挥关键作用。本研究旨在探讨hucMSC-ex转运miR-373和Let-7b修复肝纤维化的作用及机制，为肝纤维化的治疗提供新的手段。 方法：1）采用miRNeasy serum/plasma kit提取健康人和肝纤维化患者血清exosome以及健康小鼠和肝纤维小鼠肝组织及血清exosome中的miRNA，采用定量PCR检测两组血清exosome和组织中miR-373的表达。2）过表达或敲减肝星状细胞(LX-2)中miR-373，通过定量PCR、Western blot和细胞免疫荧光检测细胞中Col1、Col3、Col4和FAP的表达差异。通过Target Scan预测miR-373的靶基因 TGF-βR2，采用双荧光素酶报告基因对其进行验证。过表达或敲减miR-373后，通过定量PCR、Western blot和细胞免疫荧光检测LX-2中TGF-βR2的表达差异。3）通过 ExoQuick-TCTM 沉淀法提取 hucMSC-ex，采用透射电镜和Nanosight纳米颗粒示踪分析仪对hucMSC-ex进行观察鉴定，Western blot检测hucMSC-ex表面标记分子CD9和CD63。腹腔注射CCl4 建立肝纤维化小鼠模型，并采用 hucMSC-ex 进行移植治疗，通过活体成像仪和共聚焦显微镜观察染料标记的hucMSC-ex在体内外的定位，利用HE、Masson和Sirius Red染色观察肝组织结构和胶原分布，应用组织免疫化学、定量PCR和Western blot比较Col1、Col3、Col4 和 TGF-βR2 的表达差异。TGF-β1 诱导活化的 LX-2 细胞与hucMSC-ex共培养后，定量PCR和Western blot检测hucMSC-ex对Col1、Col3、FAP及TGF-βR2的影响。hucMSC-ex转运的miR-373(hucMSC-ex-miR-373)处理LX-2细胞后，定量PCR、Western blot和细胞免疫荧光比较细胞中Col1、Col3和FAP的表达差异，进一步检测TGF-βR2和下游分子p-smad2/3的表达水平。通过 PBS、hucMSC-ex 和 hucMSC-ex-miR-373 移植治疗肝纤维化小鼠，HE、Masson和Sirius Red染色观察hucMSC-ex-miR-373对肝组织结构和胶原分布的影响，免疫组织化学、组织可溶性胶原和、Western blot比较肝纤维化相关指标、TGF-βR2和下游分子p-smad2/3的表达变化。4）通过免疫组织化学、定量PCR和Western blot检测hucMSC-ex对TGF-βR1体内外表达的影响。通过Target Scan对TGF-βR1进行预测分析，过表达LX-2细胞中Let-7b后，定量PCR、Western blot和细胞免疫荧光检测Let-7b对TGF-βR1表达的影响。 结果：1）定量PCR结果显示肝纤维化患者血清exosome、纤维化小鼠肝组织和血清exosome中miR-373的表达水平显著低于健康组。2）miR-373过表达后，LX-2细胞中胶原合成显著降低，而miR-373敲减后，细胞中胶原相关蛋白表达显著增强。Target Scan和双荧光光素酶报告基因结果均显示miR-373可靶向结合TGF-βR2，定量PCR、Western blot和细胞免疫荧光结果显示miR-373可下调LX-2细胞中TGF-βR2及下游p-smad2/3的表达，而miR-373敲减后，细胞中TGF-βR2及下游p-smad2/3的表达显著上调。3）活体成像和共聚焦显微镜结果显示LX-2细胞可内吞近红外荧光染料Dir标记的hucMSC-ex，hucMSC-ex定位于纤维化小鼠肝组织。HE、Masson和Sirius Red染色法显示hucMSC-ex可降低组织中胶原纤维的表达。HucMSC-ex-miR-373可显著下调LX-2细胞中胶原蛋白、TGF-βR2和下游p-smad2/3的表达。相比于hucMSC-ex，hucMSC-ex-miR-373进一步降低组织TGF-βR2、p-smad2/3及胶原蛋白的表达，更显著地改善肝纤维化。4）hucMSC-ex高表达Let-7b，可通过下调TGF-βR1表达抑制肝纤维化，LX-2细胞中过表达Let-7b后，其TGF-βR1的表达显著被抑制。 结论：肝纤维化患者血清 exosomes 内 miR-373 与肝纤维化进展相关， hucMSC-ex可通过转运miR-373和Let-7b调控肝星状细胞TGF-βR2和TGF-βR1表达，抑制胶原合成，修复肝纤维化。

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